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[目的]脑缺血再灌注损伤(Cerebral ischemia-reperfusion injury,IRI)是多种神经系统疾病中共同的病理过程,在损伤区域的细胞经受氧糖剥夺与再复氧(Oxygen glucose deprivation and reoxygenation OGD/R)。环状RNA(Circular RNA,circRNA)作为非编码RNA中的一类已被证实在神经系统疾病中发挥重要的作用。非编码RNA上存在多种化学修饰,N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)是RNA上最常见的一种修饰方式,这种修饰影响多种生理病理过程。目前,大多数关于神经元中m6A修饰的研究集中在信使RNA(Messenger RNA,mRNA),circRNA上的m6A修饰特点及功能仍知之甚少。因此,本研究旨在明确神经元及OGD/R处理后的神经元中m6A circRNAs的特点及可能涉及的分子信号通路,为存在OGD/R病理过程的神经系统疾病的机制研究和治疗措施的制定提供新的思路和表观转录组学证据。[方法]1.原代神经元培养及鉴定:将孕17天的小鼠麻醉后脱臼处死,取出胎鼠,在解剖显微镜下分离大脑皮层组织,剪碎消化后,铺板培养。每隔2天进行半量换液。使用常规免疫荧光法(βIII tubulin标记神经元,DAPI标记细胞核)鉴定神经元纯度。2.OGD/R模型制备:将体外培养7天的神经元,换用无糖培养基,置入低氧环境中1.5小时和3小时后,换用正常培养基培养24小时。光镜下观察经造模处理后神经元形态的改变;TUNEL染色观察神经元在经过OGD处理后的凋亡情况;分别提取不同时间OGD/R处理神经元的总RNA及蛋白,进行qRT-PCR及Western blot检测相应指标。3.MeRIP测序文库准备:利用TRIzol法提取各个组样本的总RNA,并进行质检。在IPP缓冲液中将片段化的RNA与m6A抗体混合,并在4℃共孵育2小时。将反应混合物和protein A磁珠在4℃免疫沉淀2小时,随后使用m6A腺苷类似物将磁珠上的RNA洗脱下来。洗脱的RNA进一步通过Trizol试剂(Thermo Fisher)进行抽提。抽提纯化的RNA通过RNA建库试剂盒(NEB)建库,并在Illumina Hiseq4000测序仪上进行双端150bp测序。4.数据分析:经过Illumina HiSeq4000测序仪测序后,对测序图像进行分析,识别碱基并进行指控,获得原始reads。对原始数据进行Q30质控。使用cutadapt软件(v1.9.3)除去接头及低质量reads,得到高质量reads。使用STAR软件将input文库的clean reads匹配到参考基因组(UCSC MM10)上,再使用DCC软件进行circRNA的识别。使用Hisat2软件(v2.0.4)将全部样本的clean reads比对到参考基因组上。再使用MACS软件识别每个样本中的甲基化基因。使用diff Reps软件进行差异甲基化基因识别。对差异甲基化的m6A circRNAs进行GO和KEGG分析。[结果]1.成功体外培养小鼠大脑皮层神经元:利用常规免疫细胞化学(荧光法)鉴定的神经元纯度达到94.25±4.86%。2.OGD/R模型制备成功:光镜下可见神经元胞体膨大,轴突、树突发生形态改变,呈明显损伤迹象;TUNEL染色显示在OGD/R 1.5h组和OGD/R 3h组中均有凋亡细胞,OGD/R 1.5h神经元凋亡率约34.23±6.57%,OGD/R 3h神经元凋亡率约64.45±5.89%;qRT-PCR及Western blot检测中,Caspase3、Cleaved Caspase3、Bax表达显著上升,Bcl-2表达显著下降,各OGD/R组与对照组相比差异具有统计学意义(p<0.05)。3.正常神经元及经OGD/R处理神经元中m6A circRNAs的特点:绝大多数的m6A神经元来源于外显子;与大多数non-m6A circRNAs来源于3～4个外显子不同的是,大多数m6A circRNA来源于一个外显子,并且来源于一个外显子的m6A circRNAs对应的这一外显子长度长于多个外显子来源的m6A circRNA所对应的外显子长度,差异具有统计学意义(p<0.05);此外,来源于一个外显子的m6A circRNAs的表达水平高于来源于多个外显子的m6A circRNAs,差异具有统计学意义(p<0.05)。4.在不同的OGD/R时间(OGD/R 1.5h,OGD/R 3h)的处理下,相同的基因会产生不同的m6A circRNAs:KEGG通路富集分析显示,在OGD/R 1.5h组中,差异m6A circRNAs主要富集在AMPK信号通路和轴突引导等;在OGD/R 3h组中,差异m6A circRNAs主要富集在TGF-β信号通路。[结论]1.本研究明确了正常神经元及OGD/R处理后神经元中的m6A circRNAs的总体情况。神经元中有丰富的m6A circRNAs,在经过OGD/R(1.5h和3h)处理后,m6A circRNAs的数量下降。2.本研究阐明了神经元中m6A circRNAs来源的外显子特点。神经元中m6A circRNAs来源的外显子数量与non-m6A circRNAs不同,m6A circRNAs多来源于1个外显子,且这个外显子长度明显长于多外显子来源的m6A circRNAs对应的外显子。3.本研究明确了在不同OGD/R处理下,神经元中m6A circRNAs产生具有时间特异性。各组中差异表达的m6A circRNAs富集在不同的凋亡调控通路。为存在OGD/R病理过程的神经系统疾病的机制研究和治疗措施的制定提供新的思路和表观转录组学证据。