论文部分内容阅读
由于抗生素所具有的应用和商业价值,理性改造菌株、提高产量一直是抗生素的研究重点。本论文依据研究内容不同分为两部分。第一部分:易化扩散家族(MFS)转运蛋白是微生物中的一种膜蛋白,通常负责抗生素的外排。本文以杰多霉素生物合成簇内MFS家族蛋白JadL为例,采用基因敲除、回补、过表达等基因工程方法,首次展开这种独立存在于抗生素簇内跨膜蛋白研究。结果显示,jadL缺失株LDM胞外杰多霉素B(JdB)产量降低,生长量也有一定降低,jadL回补株LDCOM中Jd B产量恢复,jadL过表达株LOE中Jd B产量高于野生型37.87%,说明JadL可能通过外排Jd B从而提高胞外Jd B量;测试jad合成簇敲除株WVR2006菌体量正常,说明JadL通过外排杰多霉素或中间物以保证该菌正常生长;向WVR2006和jad 回补WVR2006菌株(WVR2006L)中加入Jd B时,检测WVR2006L胞内Jd B量明显低于WVR2006,进一步说明JadL负责Jd B的外排;向WT、LDM和LOE中,外源加入高浓度Jd B发现,过表达株LOE有最强的耐受能力。同样,过表达另一个头霉素C簇内MFS家族的跨膜转运蛋白CmcT也能够提高棒状链霉菌3585的头霉素C的产量。论文另一部分:在背景清楚的大肠杆菌中,以天蓝色链霉菌和双报告基因法为研究基础,通过载体构建、蛋白表达纯化、EMSA等试验,设计并构建一种灵敏高效的诱导型biosensor,在抑制蛋白库中筛选能与目标启动子结合的抑制蛋白,建立了一种有效钓取抑制蛋白的方法。结果显示,当应用诱导型启动子biosensor,以目标启动子scbA为靶点,从构建的抑制蛋白库中,钓取到了能与PscbA结合的抑制蛋白:CrpA、CrpB、Sco6323、Sco6792、Sco6784。并用 EMSA体外实验验证了其正确性,从而证实了 biosensor的灵敏性。通过操纵簇内MFS家族跨膜转运蛋白的策略和建立一种灵敏有效筛选抑制蛋白的方法,对进一步理性改造工程菌、提高抗生素产量具有重要意义。