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第一部分维格列汀改善二型糖尿病小鼠颈动脉狭窄的作用及机制研究目的:支架内再狭窄(In stent restenosis,ISR)是继发于经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)最严重的并发症之一,糖尿病作为ISR的独立危险因素与ISR的发生发展密切相关。近年来一种新型降糖药二肽基肽酶4抑制剂Dipeptyl Peptidase-4 Inhibitor,DPP-4i)开始广泛地应用于2型糖尿病的治疗,而越来越多的研究发现DPP-4i不仅可以有效降低血糖水平,还展现出对多种心血管疾病的治疗潜力。本部分旨在研究DPP-4i维格列汀对损伤诱导的二型糖尿病小鼠颈动脉狭窄的改善作用及相关机制。方法:实验纳入20只雄性2型糖尿病小鼠,结扎损伤法成功构建颈动脉狭窄模型后将小鼠随机分为2组,分别给予为期4周的维格列汀和安慰剂处理。处死小鼠取标本后对颈动脉作病理切片,HE染色评估颈动脉新生内膜增厚及管腔狭窄程度;免疫组化及免疫荧光染色检测α-SMA、PCNA、CD31阳性细胞密度,评估内皮细胞及血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs)增殖活性;免疫印迹法分析组织蛋白中α-SMA、PCNA、CD31、Cyclin D1、CDK2、phospho-p65、phospho-IKKα/β、CHOP、GRP78、ATF-6,phospho-eIF2α、phospho-IER1表达水平,评估维格列汀对内质网应激(Endoplasmic Reticulum-Stress,ER-Stress)ER-Stress与细胞核因子(Nuclear factor k B,NF-kB)信号通路的作用及机制。结果:维格列汀处理后狭窄颈动脉管腔面积增大,新生内膜面积明显减小;颈动脉中异常增殖的VSMCs数量减少,且α-SMA及PCNA双阳性细胞数量减少,而CD31阳性细胞数量未见明显改变;免疫印迹结果示,Cyclin D1、CDK2、phospho-p65、phospho-IKKα/β、CHOP、GRP78、phospho-IER1表达水平显著降低。结论:VSMCs异常增殖引起的新生内膜增生是引起颈动脉狭窄的主要原因。维格列汀抑制了颈动脉平滑肌细胞ER-Stress及NF-kB通路的激活,并通过调节VSMCs细胞周期的蛋白表达水平降低其增殖活性、改善其肥大程度,从而减少新生内膜的异常增生并改善颈动脉狭窄。第二部分ER-Stress及NF-κB调控高糖诱导的VSMCs增殖及肥大的机制研究目的:研究证明,高血糖和损伤刺激促进了动脉VSMCs中ER-Stress及NF-κB激活,并引起VSMCs异常增殖和肥大。ER-Stress及NF-κB通路之间相互作用形成正反馈环,共同参与调节细胞增殖凋亡等多种进程。第一部分中我们研究发现,维格列汀抑制ER-Stress及NF-κB的激活并抑制了VSMCs增殖和肥大,而由于维格列汀无法直接作用于VSMCs,我们通过本部分进一步研究药物阻断ER-Stress及NF-κB后对VSMCs增殖及肥大情况的影响,并探讨ER-Stress与NF-κB相互作用过程中的上下游关系。方法:提取大鼠主动脉平滑肌细胞并分别给予常规葡萄糖培养、高糖培养、牛磺酸阻断ER-Stress及ACHP(Hydrochloride)阻断NF-κB处理。CCK-8法检测并分析细胞增殖随时间变化情况;Ed U染色检测细胞增殖活性变化情况;膜片钳检测全细胞膜电容分析细胞肥大程度变化情况;免疫印迹法检测α-SMA、PCNA、phospho-IKKα/β、phospho-IER1表达水平,分析ER-Stress及NF-κB相互作用的上下游关系。结果:与单纯高糖处理的VSMCs相比,药物阻断ER-Stress及NF-κB通路后的VSMCs于24、48、72小时出现不同程度的细胞数量减少,Brdu阳性细胞数量占本组细胞总数比例显著降低,全细胞膜电容显著减小,细胞蛋白中α-SMA及PCNA表达水平显著下降。此外,免疫印迹法显示:药物阻断ER-Stress通路引起细胞中phospho-IER1及phospho-IKKα/β表达水平均显著降低,而药物阻断NF-κB通路仅降低phospho-IKKα/β表达而对phospho-IER1没有产生明显影响。结论:高糖处理可以诱导VSMCs增殖和肥大,而对ER-Stress及NF-κB通路的药物阻断可以有效降低VSMCs的增殖活性和肥大程度;ER-Stress作为NF-κB的上游通路其激活受到抑制后,通过phospho-IER1对phospho-IKKα/β调节作用进一步降低NF-κB通路的激活,并最终抑制了VSMCs的增殖和肥大。