紫锥菊毛状根培养体系的建立及其培养装置的构建

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药用植物紫锥菊(Echinacea purpurea)具有抗炎、抗菌和调节机体免疫力功能,具有显著的药理作用和极高的药用价值。而利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导药用植物产生的毛状根,无论在生物量的增加,药用有效成分的积累还是生产稳定性方面,都显示了独特的优越性,使得毛状根培养成为获得药用次生代谢物的又一重要途径。因此,本文从紫锥菊毛状根培养体系的建立、声波刺激对紫锥菊毛状根生长及次生代谢物积累的影响及声波加载式毛状根培养器的构建这三方面对药用植物紫锥菊毛状根进行了研究。首先,建立了紫锥菊毛状根的培养体系。用发根农杆菌株A4对紫锥菊叶片进行感染,同时对毛状根诱导的几个影响因素进行单因素实验和正交实验研究,实验结果表明,紫锥菊毛状根的最佳诱导条件为:感染时间8min,菌液OD600值0.8,SAAT(超声辅助农杆菌转化)处理时间1.5min,共培养温度22℃,培养基pH值6.0,此条件下紫锥菊毛状根的平均诱导率达到67%;对诱导出的根进行了PCR检测,证实其确为已转化的毛状根;对紫锥菊毛状根中的多糖和总酚进行提取和含量测定,从MS、1/2MS、White、B5和SH这五种培养基中筛选出,1/2MS培养基较适宜紫锥菊毛状根的生长及多糖和总酚的积累,其中毛状根的平均鲜重增加倍数为38.4,平均多糖和总酚含量分别为17.97%和2.32%。其次,分别研究不同强度与不同频率的声波刺激对紫锥菊毛状根生长量、多糖和总酚含量的影响,以及一定强度和频率的声波刺激下紫锥菊毛状根的生长周期变化情况。实验结果表明,声波刺激对毛状根生长周期、生长量和次生代谢物积累均能产生较大的影响,总体上以108dB和800Hz的声波促进效果较好。声波加载组比对照组早3d左右进入对数生长期及达到最大生长量。声波加载组最大平均鲜重增加倍数达到48.1,高出对照组9.5倍;培养27d后平均多糖含量为18.84%,平均总酚含量为2.49%,分别高出对照组1.05%和0.11%。最后,针对现有各种培养毛状根的生物反应器所存在的问题,结合声波刺激促进毛状根生长的研究结果,设计出一种低剪切力、传质均匀、可利用声波促进毛状根生长的新型毛状根培养器,以及使用该毛状根培养器的工艺流程,并对培养器内的声场进行了初步探讨。培养器采用超声雾化原理传输营养物质,可监测培养器内溶氧、pH、温度、传导率等各项指标,用于培养药用植物毛状根时可施加不同频率和强度的声波以提高其产量和缩短培养周期。这种声波加载式毛状根培养器的开发,是药用植物毛状根培养技术上的一个创新,对于实现药用植物毛状根的工业化生产具有重要的研究价值。
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