猪盖他病毒(Getah virus,GETV)是一种虫媒病毒,可引起马出现发热、皮疹、后腿水肿和淋巴结肿大;出生仔猪震颤、皮肤发红、精神颓废、棕黄色腹泻及较高的死亡率;母猪(尤其妊娠前期)产死胎;人体内只检测到特异性GETV抗体。GETV于1955年首次出现在马来西亚雪背库蚊中,1956年从三带喙库蚊分离到同种的鹫山病毒(Sagiyama virus,SAGV)。中国于1964年从海南省库蚊中分离出GETV分离物,并命名为M1。对蚊子、库蠓、马、猪、鸟类、狐狸和人等媒介或宿主的流行病学调查,发现盖他病毒现已广泛分布于亚洲、北欧和澳大利亚北部的太平洋沿岸。作者于2016年从中国发病猪中首次分离GETV,然而关于其对猪致病性和在中国猪群流行情况等尚不清楚。本研究通过对GETV检测方法的建立,流行毒株的分离鉴定,NSP3、Cap基因及全基因组序列测定与分析,了解其在中国猪群中的流行动态、变异特点和遗传进化方向,以期为研究GETV演变过程、致病机理和科学防控提供依据。试验一猪盖他病毒RT-PCR方法的建立及应用根据已报道的GETV基因序列设计了一组针对NSP3基因的特异性引物,成功建立了灵敏、特异的检测GETV的RT-PCR方法,其最低检出限量为102.25TCID50/m L。应用该技术对田间收集的79份疑似GETV感染猪病料进行检测,阳性检出率为5.08%(4/79),其中3份来自有腹泻呕吐的仔猪肠道,1份是妊娠前期母猪所产的流产胎儿。本试验首次使用自行建立的RT-PCR从发病猪中检测出GETV,为了解其在中国猪群中流行情况提供技术支撑。试验二猪盖他病毒五重RT-PCR方法的建立及应用针对GETV可导致乳猪腹泻且临床中存在腹泻病毒混合感染情况,作者建立了五重RT-PCR检测方法一次可同时检出5种病原。针对GETV的Cap基因、PEDV的E基因、TGEV的S基因、Po RV的VP6基因和PDCo V的N基因设计5对特异性引物,通过固定d NTP、Mg Cl2、ATP和dd H2O等条件,优化引物浓度、退火温度和延伸时间,确定五重RT-PCR方法最佳扩增条件如下:每对引物物质的量浓度比为30:10:3:2:2,退火温度57°C,延长时间80s,40个循环。用本方法对来自河南省3市6个养殖场共93份有腹泻症状猪样品的检测显示PEDV阳性率最高(23.66%),GETV阳性检出率为6.45%。与单一RT-PCR相比,结果符合率为100%,提示该法应用于临床样品中病原检测具可靠性和实用价值,可应用于临床鉴别诊断。试验三猪盖他病毒Cap蛋白的原核表达及多克隆抗体制备为建立安全的血清学检测方法,本试验从HNJZ-S1毒株中扩增出Cap全长基因序列,克隆至携带有His标签的原核表达载体p ET28a中,通过PCR、双酶切和序列测定鉴定后,重组质粒p ET28a-Cap转化至E.coli BL21,IPTG诱导表达;SDS-PAGE检测,镍柱纯化,Western-blot鉴定蛋白;纯化蛋白免疫Bal/c小鼠,制备多克隆抗体。结果表明:经终浓度0.1mmol/L IPTG 20℃诱导12h后,Cap基因获得高效表达,可融性蛋白相对分子质量为35KDa。制备的鼠源抗血清能与融合蛋白发生特异性反应。本研究获得的纯化Cap蛋白及多克隆抗体,为进一步研究Cap结构和功能、建立GETV抗体检测试剂盒及进行GETV基因工程疫苗研究奠定了基础。试验四中国4省GETV NSP3及Cap基因检测及序列分析为了解我国猪盖他病毒流行情况,本研究利用RT-PCR方法在国内首次对晋、冀、豫、皖4省231个猪场的801份猪脏器、组织进行了GETV的病原学调查及部分基因序列分析。结果显示,从4省份的猪群样品中均检出GETV,其中32个阳性养殖场的病料中检出阳性样品共37份,样品阳性率为4.62%,猪场阳性率为13.9%,并首次从种公猪精液中检出GETV。对Cap和NSP3基因序列分析发现,目前中国猪群中的GETV与日本近年马源、猪源及蚊源毒株亲缘关系最近,其次是中国近年蚊源和韩国猪源毒株。推导的氨基酸序列分析结果与Cap和NSP3基因结果基本一致,且均与2012年以来的所有日本毒株亲缘关系最近。本研究首次揭示我国被测的4省份猪群中均有GETV存在,且种公猪也可带毒,应引起人们重视。鉴于国内外目前均把该病毒看作是人兽共患病病原,因此有必要对其在中国猪群中的感染谱、传播途径、流行规律、致病性及防控措施等进行深入研究,为实时了解其在人畜间的感染和流行情况、制定有效防控措施提供科学依据。试验五同一猪场疫苗源和猪源不同GETV分离株的比较分析临床检测时从某猪场送检的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活疫苗中检出并分离到一株GETV。为初步了解中国境内猪用商品活疫苗GETV污染情况及使用该污染疫苗场家猪群中GETV流行情况,作者应用RT-PCR和病毒分离技术,从6个生物制品厂家6类63批次的市售猪用活疫苗中检出1个厂家一种PRRSV疫苗多批次为GETV阳性,批次阳性率4.76%,并分离鉴定出一株GETV(GETV-V1);从使用有GETV污染的PRRSV活疫苗的猪场流产胎儿中,分离鉴定出一株GETV(AH9192);其中GETV-V1和AH9192的毒价和序列长度分别为106.32TCID50/m L和106.89TCID50/m L,11689bp和11681bp。两株GETV全基因的相似性和氨基酸差异位点显示,与2016年日本马源GETV毒株16-I-599相似性最高(核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%~98.9%和98.2%~98.5%);在NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、Cap、E2、6K和E1蛋白中存在数量不等的氨基酸突变,其中E1区域最多且在969aa处插入一个具有亲水活性的Cys,首次发现在AH9192毒株基因组编码的NSP3的1818aa处有连续3个氨基酸缺失。全基因序列分析,GETV-V1和AH9192处在同一分支中,与近年中国蚊源毒株HB0234和YN0540以及日本2012年的蚊源12IH26、2015年的猪源毒株15-I-1105和2014年马源毒株14-I-605-C1处在一个大的分支内,其中与2004年韩国猪源毒株South Korea亲缘关系最近。总的来说,猪源AH9192与疫苗源GETV-V1遗传距离最近,且这两个毒株均与日、韩毒株关系相近,因此推测其可能通过韩国或日本传入中国。试验六豫皖两省5株猪源GETV的分离鉴定及全序列分析利用RT-PCR检测、CPE和测序,2016~2017年作者从豫、皖两省病猪的脏器、组织和流产胎儿的分离物中鉴定出5株GETV(HNNY-1、HNNY-2、HNPDS-1、HNPDS-2和AH9192),其基因组全长分别为11689 bp、11689 bp、11689 bp、11689 bp和11681 bp。通过与中国首株蚊源GETV M1、蚊源HB0234株、首株猪源分离物HNJZ-S1、韩国猪源South Korea株、日本蚊源12I26株和猪源15-I-1105株的序列相似性和氨基酸位点差异比较,发现本文5株猪源分离物与国内首株猪源GETV HNJZ-S1的相似性最高(依次分别为99.5%、99.8%、99.5%、99.5%和97.1%);与15-I-1105和South Korea的相似性次之。在多聚非结构蛋白及多聚结构蛋白中都存在数量不一的氨基酸替换,其中在E1、E2、Cap和NSP3区域替换较多。值得注意的是AH9192株在NSP3/ns P4切割位点上游的1717aa、1742aa和1790aa处存在Q→R、A→T和T→I氨基酸替换,1818aa位点有连续3个氨基酸缺失;而HNNY-1、HNNY-2、HNPDS-1、HNPDS-2和参考毒株HZJZ-S1在Cap蛋白的34aa处皆有一个Ser插入。与以往报道不同,5个GETV毒株在E1蛋白区域发现有24个变异位点。系统发育分析表明,5株分离物与近年日本、中国和韩国GETV分离株处在同一分支中,整体上与2012~2016年流行在日本马群(14-I-605-C1)、猪群(15-I-1105)和蚊子(12IH26)中的毒株遗传关系近,其中HNNY-1与中国首株猪源毒株HNJZ-S1遗传距离最近,处在一个小分支中,HNNY-2、HNPDS-1和HNPDS-2次之,AH9192与2004年韩国South Korea亲缘关系相近。本研究结果将GETV粗分为3个基因群或谱系(clade),并显示其演化具有明显的时间节点和地域特征,但未发现明显的物种差异。谱系Ⅲ的毒株数量最多(37/49),谱系Ⅱ是一个过渡群,谱系Ⅰ是一个最古老的谱系。本研究通过对5个GETV分离株的全基因组序列分析,初步掌握了GETV在豫皖两省猪群中最新流行动态及变异情况。