猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是近年来发现的一种新的病毒,引起猪的繁殖和呼吸系统症状。该病以繁殖母猪发热、厌食和流产、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。而且该病通过胎盘、空气等多种途径传播,所以对PRRSV的检测及预防尤为重要,建立一种快速高效的诊断方法对于PRRSV的控制具有重大意义。本试验主要进行了如下研究。将美洲型VR 2332株细胞毒提取总RNA,根据GenBank上的参考序列设计了一对扩增猪蓝耳N基因的特异性引物,在引物的上下游分别带有BamHI、HindⅢ酶切位点。通过RT-PCR获得长约372bp的目的片段。将其克隆到pMD18-T载体,获得重组质粒pMD-N。用相同的限制性内切酶酶切阳性质粒pMD-N和表达载体pET-32a后构建重组表达载体,转化宿主菌BL21,经酶切及PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序证明目的基因以正确的阅读框插入了表达载体,用0.1mol/L的IPTG诱导表达N蛋白主要抗原区,再以28℃继续培养5 h,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,原核表达产物大小约为34 kDa。这样的培养条件下表达量最大,经分析表达蛋白量约占菌体蛋白的20.1%。表达产物经Western-blotting分析,能被猪繁殖与呼吸综合征高免血清所识别。试验结果表明猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白抗原区在大肠杆菌中高效表达且表达产物具有抗原性。目的蛋白经大量诱导表达,可溶性试验证明重组蛋白部分以可溶性形式存在于诱导菌液上清中,本实验用镍柱亲和层析法从上清中纯化了目的蛋白。纯化后的目的蛋白作为抗原包被聚乙烯微量反应板,初步建立检测PRRSV抗体的间接ELISA诊断方法。实验结果表明:抗原的最适包被浓度为51.7μg/mL,血清最适稀释度为1:50,最佳血清反应时间确定为37℃15min,二抗反应时间确定为37℃10min,底物显色液的最佳反应时间为5 min。统计学分析后确定阴阳性的临界值为0.35。经重复性试验、交叉试验等试验,结果表明该方法重复性好、特异性强、敏感度高;将建立的N-ELISA方法与美国IDEXX公司PRRSV抗体检测试剂盒相比较,其特异性和敏感性分别为85.7%和94.7%,符合率达到91.7%,统计学分析,这两种检测方法的检测结果无显著性差异。该方法的建立为蓝耳病毒抗体监测提供了一种比较实用的血清学检测方法。