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前言乳腺癌占所有女性肿瘤的25%,是迄今为止全球女性最常见的恶性疾病。致死原因大多是原发肿瘤细胞经血道或淋巴道转移至远处器官。基因特征已可以定义乳腺癌的生物学分类,但其侵袭转移的分子学基制还研究很少。最近研究发现纤维生长因子诱导14（Fibroblast growth factor inducible 14,Fn14）是一种肿瘤特异的细胞表面标记物,已发现其在食管癌,肝癌,乳腺癌,神经胶质瘤中有异常高表达。肿瘤中Fn14基因激活的机制尚不明确。Fn14同其它肿瘤坏死因子受体（Tumor Necrosis Factor Receptor Associated,TNFR）超家族成员一样没有固有的蛋白激酶活性,但可以和接头分子结合,激活细胞内信号通路包括:NF-kB,JNK,ERK和p38活化。肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumor Necrosis Factor Receptor AssociatedFactor,TRAFs）就是一组参与TNFR超家族信号途径的接头分子,其中TRAFs（TRAF1,2,3,5）可分别连接到有重叠但不相同的鼠Fn14的胞质区。Fn14与TRAFs的作用机制尚无明确报道。已经有大量研究证实,在TRAFs家族所有成员中,TRAF1与TRAF2的关系最为密切。但是对于TRAF1,TRAF2的具体作用,一直存在着一些矛盾的观点。目前尚无Fn14影响TRAF1,TRAF2结合从而影响NF-kB通路及乳腺癌细胞生物学行为的报道。我们研究发现乳腺癌细胞系中Fn14的表达可调节TRAF1,TRAF2的结合量及Fn14分别与TRAF1,TRAF2的结合量,影响NF-kB信号通路,同时调节乳腺癌细胞的增殖,凋亡,侵袭力。材料与方法1、细胞正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,人雌激素受体非依赖性乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MDA-MB-435s用含有10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,5%CO2的培养箱内培养。2、转染按照LipofectAMINE2000说明书操作。3、免疫荧光检测细胞中Fn14蛋白的表达。4、RT-PCR检测Fn14mRNA表达情况。5、免疫共沉淀检测Fn14、TRAF1、TRAF2蛋白之间的结合。6、Western blot检测乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-435s转染前后NF-kB信号通路的活化情况。7、流式细胞仪检测按照细胞凋亡与坏死检测试剂盒操作说明进行,Hoechst/PI双标后经流式细胞仪检测凋亡发生的比例。8、四甲基偶氮唑蓝（MTT）法接种各组细胞至96孔培养板,培养24-120h,按照操作说明进行,用酶联免疫检测仪测量各孔在490nm处的吸光值（A490）,根据吸光值绘制细胞增殖曲线。9、Transwell小室检测接种各组细胞分别至Matrigel包被的含有微孔滤膜的Transwell小室,分别培养24h后,4%多聚甲醇固定,苏木素染色,显微镜观察细胞体外侵袭能力的变化。10、使用SPSS14.0统计软件进行数据处理,以p＜0.05为有统计学意义。结果1、转染pcDNA3.0-WT-Fn14上调TRAF1、TRAF2的结合,Fn14与TRAF1的结合,Fn14与TRAF2的结合,I-κBα的磷酸化水平免疫共沉淀结果显示:转染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s细胞组TRAF1与TRAF2蛋白结合量明显增高,Fn14与TRAF1蛋白结合量,Fn14与TRAF2蛋白结合量明显增高,与未转染对照组比较差异均有统计学意义（p＜0.05）。Western blot显示:转染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s细胞组I-κBα的磷酸化水平增高。2、转染Fn14SiRNA下调TRAF1、TRAF2的结合,Fn14与TRAF1的结合,Fn14与TRAF2的结合,I-κBα的磷酸化水平免疫共沉淀结果显示:转染Fn14SiRNA的MDA-MB-231细胞组TRAF1与TRAF2蛋白结合表达量明显减低,Fn14与TRAF1蛋白结合量,Fn14与TRAF2蛋白结合量明显减低,与未转染对照组比较差异有统计学意义（p＜0.01）。Western blot显示:转染Fn14SiRNA的MDA-MB-231细胞组I-κBα的磷酸化水平减低。3、转染pcDNA3.0-WT-Fn14诱导细胞的增殖侵袭能力,抑制细胞凋亡MTT法测定结果显示:pcDNA3.0-WT-Fn14质粒转染的细胞增殖能力明显高于空白对照组和lipo对照组（P＜0.01）;而对照细胞间相比无明显差异（P＞0.05）。流式细胞仪检测结果显示:转染pcDNA3.0-WT-Fn14组细胞凋亡率13.3±1.05%,明显低于对照组细胞41.5±2.15%（P＜0.01）。Transwell侵袭试验结果显示:MDA-MB-435s细胞的侵袭相对数为18.7±3.5,转染pcDNA3.0-WT-Fn14的MDA-MB-435s细胞的侵袭相对数为67.0±2.6。转染pcDNA3.0-WT-Fn14组细胞的侵袭相对数明显高于对照组细胞,差异具有统计学意义（P＜0.01）。4、转染Fn14SiRNA抑制细胞的增殖侵袭能力,诱导细胞凋亡。MTT法测定结果显示:Fn14siRNA转染的细胞增殖能力明显低于空白对照组和lipo对照组（p＜0.01）;而各对照细胞相比无明显差异（p＞0.05）。流式细胞仪检测结果显示:转染Fn14siRNA组细胞凋亡率42.6±4.56%,明显高于对照组细胞54.0±3.7%（p＜0.01）。Transwell侵袭试验结果显示:MDA-MB-231细胞的侵袭相对数为29±1.6,转染Fn14SiRNA的MDA-MB-231细胞的侵袭相对数为7.6±3.5。转染Fn14SiRNA组细胞侵袭相对数明显低于对照组细胞,差异具有统计学意义（p＜0.01）。结论pcDNA3.0-WT-Fn14质粒能有效诱导MDA-MB-435s细胞中TRAF1与TRAF2的结合,Fn14与TRAF1的结合,Fn14与TRAF2的结合;上调I-κBα的磷酸化水平;并能促进肿瘤的增殖、侵袭,抑制细胞的凋亡。Fn14siRNA能有效抑制MDA-MB-231细胞中TRAF1与TRAF2的结合,Fn14与TRAF1的结合,Fn14与TRAF2的结合;下调I-κBα的磷酸化水平;并能抑制肿瘤的增殖、侵袭,促进细胞的凋亡,为乳腺癌的基因治疗提供了一种新策略。