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猪附红细胞体是一类可以致使猪贫血的病原菌,它具有高度传染性。该病原体能够引起猪急性传染性贫血,导致母猪繁殖障碍,生长缓慢。由于该病原体和其他疾病交叉感染频繁,致使疾病诊断和治疗更加难度,给全世界养猪业的发展带来了非常巨大的损失和威胁。附红细胞体ENO基因的特异性引物是根据GenBank中该序列的开放框设计合成的。PCR产物克隆到PMD19T-Simple Vector后经Kpn I和Xho I双酶切,进行凝胶电泳和切胶回收并构建真核重组表达质粒PVAX1-ENO。转染到Vero细胞中进行表达,转染的介质用lipofectamine 2 000。选择Vero细胞作为该基因真核表达的细胞。显微镜下观察免疫荧光结果,于细胞表面可观察到较完整的绿色荧光。表明特异性蛋白被该基因成功的表达。同时构建了重组腺病毒穿梭质粒ADV4-ENO,ADV4-ENO和腺病毒骨架质粒共转染到293 T细胞后成功构建了Ad5-ENO重组腺病毒,将Ad5-ENO扩增之后进行存化。制备了Ad5-ENO重组腺病毒载体疫苗。应用构建的PVAX1-ENO疫苗和制备的Ad5-ENO重组腺病毒疫苗免疫接种BALB/c小鼠,设置Prime-Boost策略组,Ad5-ENO重组腺病毒疫苗组、PVAX1-ENO核酸疫苗组、PVAX1组、PBS对照组。每次免疫后对小鼠进行采血并分离血清,通过ELISA法测定血清中的猪附红细胞体特异性抗体IgG,IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平。三免2周后,将每组BABL/c小鼠随机选取3只,通过流式细胞仪测定小鼠脾脏淋巴细胞中的CD4~+和CD8~+。结果显示,成功构建PVAX1-ENO核酸疫苗和Ad5-ENO重组腺病毒疫苗,获得Ad5-ENO重组腺病毒滴度为1010PFU/m L。接种BALB/c小鼠后,Prime-Boost免疫策略组、Ad5-ENO疫苗组、PVAX1-ENO核酸疫苗组的猪附红细胞体特异性抗体IgG,IgG1、IgG2a的抗体水平极显著高于PVAX1空载体组和PBS对照组(P<0.01);Prime-Boost免疫策略组、Ad5-ENO疫苗组、PVAX1-ENO核酸疫苗组的IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于PVAX1空载体组和PBS对照组(P<0.01)。淋巴细胞亚群CD4~+、CD8~+分析表明,Prime-Boost免疫策略组、Ad5-ENO疫苗组、PVAX1-ENO核酸疫苗免疫组的CD4+水平极显著高于PVAX1空载体组和PBS对照组(P<0.01);PVAX1组和PBS对照组的之间无显著性差异(P>0.05)。Prime-Boost免疫策略组的CD8~+水平显著高于Ad5~-ENO疫苗组、PVAX1-ENO核酸疫苗组、PVAX1空载体组、PBS对照组(P<0.05);Ad5-ENO疫苗组、PVAX1-ENO核酸疫苗组、PVAX1空载体组、PBS对照组之间无显著差异(P>0.05)。Prime-Boost免疫策略组、Ad5-ENO疫苗组、PVAX1-ENO核酸疫苗组的CD4+和CD8~+比值显著高于PVAX1空载体组与PBS对照组(P<0.05)。该试验为附红细胞体病新型疫苗的制备及附红细胞体免疫策略的研究奠定了基础。