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海带是一种重要的药食两用海洋资源,富含生物活性多糖。本文主要开展了抗动脉粥样硬化和免疫调节活性海带多糖的分离纯化与结构鉴定方面的研究,获得了如下实验结果: (1)海带多糖的分离纯化及其结构鉴定:采用DEAE-Cellulose离子交换色谱、Sephacryl S-500凝胶渗透色谱技术对海带总多糖进行分离纯化,获得3个多糖均一组分 LJP11、LJP12和LJP31,分子量分别为2.45×107 Da、1.8×107 Da、1.1×107Da。单糖组成分析及甲基化分析得到,LJP11主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成,分子摩尔比为1:1.16:6.33,主链主要包含1,4-β-D-Glcp、1,4-2-O-acetyl-β-D-Glcp、1,3,6-α-D-Manp和1-β-L-Araf。LJP12主要由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,分子摩尔比为1:0.17:1.54:2.64:0.18,主链主要包含1,3,6-α-D-Manp、1-α-D-Galp、1,4-2-O-acetyl-β-D-Manp、1,4-β-D-Glcp和1-β-L-Araf。LJP31主要由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,分子摩尔比为1:7.8:6.6:0.8,主链主要包含1,4-2-O-acetyl-β-D-Manp、1,3,6-α-D-Manp、1,4-β-D-Glcp、1-β-L-Araf、1-α-D-Glap和1,4-β-D-Manp。 (2)LJP11的免疫调节活性及作用机理:MTT实验显示,在考察浓度范围内,LJP11显著促进RAW264.7细胞的生长(p<0.01)。培养液中NO和细胞因子的含量分析显示,LJP11不仅能促进巨噬细胞产生NO、TNF-α和IL-6,而且能抑制IL-10的分泌,当多糖浓度为200μg/mL时,NO、TNF-α和IL-10的分泌量达到最大,分别比对照组提高了77％、12.6%和19.7%,当多糖浓度为100μg/mL时, IL-6的分泌量分别达到最大。qRT-PCR分析发现,LJP11对RAW264.7细胞产生NO和细胞因子的影响与其调控相关蛋白的基因表达密切相关,当多糖浓度达到200μg/mL时,iNOs、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10 mRNA表达分别比对照组提高了65.7%、75.3%、270%、120%和16.9%。Western blot结果显示, LJP11有助于促进RAW264.7细胞NF-κB p65蛋白发生核迁移和IκB蛋白的磷酸化,提示LJP11能够激活RAW264.7细胞NF-κB信号通路, LJP11能显著促进细胞JNK、ERK1/2和P38蛋白的磷酸化,提示该多糖能从活化JNK、ERK1/2和P38三方面激活MAPK信号通路。这些结果表明,对炎性信号通路MAPK和NF-κB的调控作用是LJP11免疫调节活性的重要分子机制。 (3)LJP12的抗动脉粥样硬化活性及其分子调控机制:病理学研究显示,海带多糖LJP12能显著抑制高脂饲料诱导的LDLr-/-小鼠动脉粥样硬化的发生和发展,呈量效关系。当LJP12剂量达到200 mg/kg·day时,血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、NO、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6、VCAM-1、ICAM-1和MCP-1含量分别比高脂饲料组减小了58.2%、46.0%、50.9%、61.2%、57.3%、28.0%、37.4%、22.8%、36.0%、21.1%、24%和32.3%,而SOD、IL-10分别比高脂饲料组提高了57.3%和80%;血管中促炎因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1和MCP-1的mRNA表达比对照组降低了86.6%、93.5%、82.1%和67.7%,而抗炎因子IL-10的mRNA表达是对照组的21.3倍。Western blot分析发现,LJP12能显著抑制血管中NF-κB p65、JNK、ERK1/2和P38等蛋白的磷酸化,其中多糖剂量为200 mg/kg·day时,它们分别比对照组降低了70%、87.1%、51.8%和58.3%。这些结果表明,LJP12可能是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路,抑制促炎因子的表达,进而抑制动脉粥样硬化的发生发展。 (4)LJP31的免疫活性及作用机理:MTT实验表明,在实验浓度范围内(50~400μg/mL),LJP31对RAW264.7细胞无毒性作用。培养液中NO和细胞因子的含量分析显示,LJP31不仅能促进巨噬细胞产生NO、TNF-α和IL-6,而且能抑制IL-10的分泌,当多糖浓度为200μg/mL时,TNF-α和IL-6的分泌量达到最大,分别比对照组提高了13.8%、200%和21.4%,当多糖浓度为100μg/mL时,NO的分泌量分别达到最大。qRT-PCR分析发现, LJP31对RAW264.7细胞产生NO和细胞因子的影响与其调控相关蛋白的基因表达密切相关,当多糖浓度达到200μg/mL时,iNOs、TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10mRNA表达分别比对照组提高了59%、410%、300%、120%和26%。Western blot结果显示, LJP31有助于促进RAW264.7细胞NF-κB p65蛋白发生核迁移和IκB蛋白的磷酸化,提示LJP31能够激活RAW264.7细胞NF-κB信号通路,LJP31能显著促进细胞JNK、ERK1/2和P38蛋白的磷酸化,提示该多糖能从活化JNK、ERK1/2和P38三方面激活MAPK信号通路。流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析发现, TLR4是LJP31作用于RAW264.7细胞的细胞表面特异性靶分子。这些结果表明,LJP31可以通过识别RAW264.7细胞表面的TLR4受体,激活细胞内MAPK和NF-κB等炎性信号通路,调控细胞因子的表达,从而发挥LJP31免疫调节活性。