三代测序凭借其超长读长、高通量、无GC偏移成为基因组从头组装、转录组全长测序、结构变异、拷贝数变异、甲基化研究的新利器。其中,Pacific Biosciences（Pac Bio）公司开发的单分子实时测序技术（Single Molecular Real-Time,SMRT）采用边合成边测序的技术,读长可达几kb甚至至几十kb。然而Pac Bio公司的单分子实时测序技术单次测序的错误率非常高,对于如何提高SMRT测序的准确率一直是一个需要解决的关键问题,目前Pac Bio公司推出的最新测序系统sequel和sequelⅡ主要通过提高测序酶活性,同时构建10 kb左右的测序文库以提高测序的覆盖率,通过独特的“套马索”（SMRTbell）结构将测序下机的子序列做循环一致性处理（CCS）,进而获得准确率较高的序列,这些准确率较高的序列也被称为High-Fidelity reads（Hi Fi-reads）。纵使Hi Fi-reads覆盖度达到了28×,但精确度仍只有99.8%,难以满足对精确度要求高的数据分析。本研究拟结合NGS多标记混合技术和Pac Bio SMRT测序技术优势,将Illumina二代测序96组双端barcode序列结合到动物mt DNA PCR通用引物上,改良三代混合测序分子实验流程,同时开发混合测序数据分析软件,最终实现线粒体基因组高通量混合测序,提高混合样本数量的同时,降低单个样本测序成本。基于此思路,本研究以线粒体为研究对象,混合了79只藏獒、7只岩羊、一只雪豹共87个个体,最终成功构建了长分别为～8.6 kb和～8.8 kb的带有标签序列的mt DNA长扩增子混合测序文库,获得763,518条目的片段大小的子序列,平均测序深度为4,338×,经循环一致性处理后得到约6万条目标大小的Hi Fi-reads,平均每个样品的每个片段约有340条。本课题开发的分析软件包（HQGr）将不同物种的不同片段进行了拆分,获得每个样品的F1片段平均测序深度为183×,F3片段平均测序深度为148×,最终获得的High Quality Reads（HQ-reads）准确率高达QV50。本研究改良的流程和开发的分析软件包为小型基因组测序,如线粒体、叶绿体及细菌的基因组,高重组区段候选基因测序提供了一套良好的测序方案及分析流程。