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研究背景及目的：骨肉瘤是临床最常见的原发恶性肿瘤之一,起源于间叶组织,恶性程度高,且术后易复发及转移,因此死亡率较高。近年来,随着临床辅助化疗手段及外科技术的广泛应用,治疗水平逐步提高,骨肉瘤的治疗得到较明显的改善,但复发和转移仍是导致患者死亡的难以解决的两大问题。据统计,远处转移,特别是肺转移是骨肉瘤致死最主要原因,约占骨肉瘤患者死亡比例的80%-90%。因此,探索骨肉瘤转移的相关机制,并在此基础上寻找有效的针对骨肉瘤的诊疗方法,目前已成为骨肉瘤治疗工作中亟需解决的问题。肿瘤睾丸(cancer testis, CT)抗原是一类人表面抗原蛋白,在人体多种肿瘤组织中高表达,在正常人体组织中仅表达于睾丸和胚胎组织,而在人体其他正常组织中极少或基本不表达。CT抗原是一种很好的肿瘤标记物,目前临床已将CT抗原用于肿瘤的诊断、转移监测等方面。目前已有大量研究证实CT抗原基因产物参与细胞分化、信号传导、转录、翻译及染色质重塑信号通路,故CT抗原被认为是一种新的有重要意义的肿瘤发生及转移的生物标志物。精子相关抗原9(sperm associated antigen 9, SPAG9)基因是新发现的一种抗原,属于CT抗原家族成员之一,在很多人类肿瘤组织中高表达,提示SPAG9在人类肿瘤细胞中可能扮演癌基因的角色,但是SPAG9在人骨肉瘤中的作用及具体作用机制尚不明确。本实验拟将SPAG9作为本次研究的研究目标和研究对象,寻找SPAG9在骨肉瘤细胞系U20S中所发挥的作用,并对其作用机制进行相关探索。研究和探讨SPAG9在人骨肉瘤组织中的表达、作用及其可能的作用机制,并从分子水平分析、比较SPAG9对骨肉瘤生物学行为的影响,从而为骨肉瘤相关转移机制提供新的研究思想和实验基础,进而为临床对骨肉瘤早期诊断、转移监测及分子靶向治疗提供理论依据。方法：1.利用荧光定量PCR和免疫印迹技术研究SPAG9在骨肉瘤组织和癌旁组织中的表达情况。2.针对SPAG9设计证实有效的SPAG9小干扰片段,分别用siRNA-Ctr1(对照组)和siRNA-SPAG9 (实验组)小干扰RNA片段对骨肉瘤细胞U20S基因干扰,Western Blot实验检测SPAG9蛋白表达量。3.细胞增殖实验检测SPAG9基因干扰后对骨肉瘤细胞U20S增殖活性的影响。4.划痕实验检测SPAG9基因干扰后对骨肉瘤细胞U20S迁移能力的影响。5. Transwell细胞迁移实验和侵袭实验检测SPAG9基因干扰后对骨肉瘤细胞U20S的细胞迁移和侵袭能力的影响。6.小管形成实验检测SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S培养上清对诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)小管形成能力和增殖活性的影响。7.明胶酶谱实验检测SPAG9基因干扰后对骨肉瘤细胞U2O分泌MMPs活性的影响。8.免疫印迹实验检测SPAG9基因干扰后对骨肉瘤细胞U2OS中MMPs和VEGF蛋白表达量的影响。9.荧光定量PCR检测SPAG9基因干扰后对骨肉瘤细胞U2OS中MMPs和VEGF基因表达的影响。10. ELISA实验检测SPAG9基因干扰后对骨肉瘤细胞U2OS培养上清中VEGF含量的影响。结果：1.组织样本的荧光定量PCR结果显示：与癌旁组织相比,SPAG9在骨肉瘤组织中的基因表达增加(P<0.05)；组织样本的免疫印迹结果显示：与癌旁组织相比,SPAG9在骨肉瘤组织中的蛋白表达增加(P<0.05),差异有统计学意义。2.设计3对干扰片段,荧光定量PCR和免疫印迹结果显示：SPAG9 siRNA-2可以显著抑制骨肉瘤细胞U2OS中的SPAG9的基因和蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。3.细胞增殖实验结果显示：和对照组相比,SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S的增殖活性没有明显影响,差异无统计学意义(p>0.05)。4.划痕实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰12小时后,骨肉瘤细胞U2OS的迁移能力减少17%,而在24小时,其迁移距离减少26%,其差异有统计学意义(P<0.05)。5. Transwell细胞迁移实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后48小时,骨肉瘤细胞U2OS的迁移数量减少了66%,其差异有统计学意义(P<0.05)。6.细胞侵袭实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后48小时,骨肉瘤细胞U20S的迁移数量减少了69%,其差异有统计学意义(P<0.05)。7.小管形成实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S培养上清HUVECs形成的平均管样结构数降低了55%,差异有统计学意义(P<0.05)。8. HUVECs细胞增殖实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S培养上清HUVECs的增殖活性降低66%,差异有统计学意义(P<0.05)。9.明胶酶谱实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的活性分别减少了59%和61%,差异有统计学意义(P<0.05)。10.免疫印迹实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的蛋白水平分别减少了47%和52%,而VEGF的蛋白表达降低了54%,差异均有统计学意义(P<0.05)。11.荧光定量PCR实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的基因表达分别减少了37%和58%,差异有统计学意义(P<0.05)。12. ELISA实验结果显示：与对照组相比,SPAG9基因干扰后骨肉瘤细胞U20S的VEGF分泌量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论：SPAG9蛋白在人类骨肉瘤组织中的表达水平增高；SPAG9基因干扰后可以显著抑制骨肉瘤细胞U20S MMP2和MMP9的表达和酶活性,进而抑制骨肉瘤细胞U20S的迁移和侵袭能力；SPAG9基因干扰后抑制了骨肉瘤细胞U20S分泌VEGF的能力,VEGF的蛋白水平受到抑制,进而导致骨肉瘤细胞U20S促进体外形成血管样结构能力的降低。