大口黑鲈弹状病毒病是一种严重危害鲈鱼健康养殖的病毒性疾病,其病原为大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoides rhabdovirus,MSRV）。疫苗接种作为一种绿色、安全、高效的预防手段,在水产病毒性疾病防控方面取得了较好效果,得到了广泛重视和关注。本研究在具有较好免疫效果的MSRV G2蛋白疫苗的基础上,开展G2基因密码子优化、高效原核表达载体筛选、表达条件优化和发酵工艺优化等方面研究,旨在提高G2蛋白的原核表达量和规模发酵产量,为建立高产低耗的生产线提供参考,降低实际应用中的疫苗生产成本。1.大口黑鲈弹状病毒G2蛋白密码子优化、表达载体筛选以本实验室前期已确定具有较好免疫效果的G2蛋白为基础进行密码子优化,通过EMBOSS软件中的CHIPS和CUSP程序及Codon W1.4.2软件对优化序列和原序列进行对比,以密码子适应指数（Codon Adaptation Index,CAI）、有效密码子数（Effective Number of Codon,ENC）和GC3s值等为衡量指标进行偏好性分析,密码子使用频率比值确定合适的表达宿主,结果显示:优化序列CAI值由0.54提升到0.78,GC3s值由45%升高到55%,ENC值从47.99降低至44.77,且优化后序列与大肠杆菌密码子使用频率相差较大的只有5个,说明大肠杆菌是最合适的表达宿主;将优化后的序列G2-opti分别连接5个候选表达质粒p ET-25b、p ET-28a、p ET-32a、p GEX-6P-1、p Cold I,保证其余条件相同,用以确定最优表达载体。结果表明:以p ET-32a作为原核表达载体时,更有利于外源基因在大肠杆菌中的表达。2.G2蛋白表达条件优化及免疫效果验证为进一步提高G2蛋白的表达产量,利用单因素试验确定影响蛋白表达量的三种因素（诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间）的最佳条件,在此基础上利用Box–Behnken中心组合试验探究三种因素之间的交互作用,结合响应面法（Response Surface Methodology,RSM）确定三种因素对目的蛋白产量的综合影响,利用Design expert 8.0.6软件筛选G2蛋白原核表达的最优表达条件。从结果来看通过响应面法优化表达条件,在实验室条件下,当诱导剂浓度0.8 mmol/L、诱导温度29℃、诱导时间5 h,目的蛋白的产量由40.5%提高到60.1%,蛋白浓度由0.53g/L提高到0.75g/L;以密码子优化后的G2蛋白进行浸泡免疫,设置不同免疫浓度（5mg/L、10mg/L、40mg/L）和PBS对照,收集血清并测定抗体效价。结果表明,用密码子优化后的G2蛋白进行浸泡免疫后,依然具有免疫保护效果。3.大肠杆菌重组G2蛋白发酵工艺优化为在工业生产中获得足量目的蛋白,本研究以5L发酵罐进行G2蛋白小规模发酵,研究其接种量、培养温度、补料培养基配方、诱导温度和诱导剂浓度对目的蛋白产量的影响,为后续规模化生产奠定基础。结果表明,当接种量为5%,培养温度为40℃,补料培养基配方为胰蛋白胨60 g,酵母浸出物30 g,氯化钠60 g,葡萄糖60 g,诱导剂浓度为0.8 mmol/L,诱导温度为30℃时,可获得最大菌体湿重58.9g/L,蛋白浓度为2.03g/L,为后期工业上大规模发酵制备G2蛋白提供了重要参考。综上所述,本研究通过密码子优化、表达载体选择、蛋白表达条件和发酵工艺优化等多项技术工艺提高了G2蛋白的产量,为疫苗的规模化生产提供借鉴和参考,对渔用疫苗的推广应用具有重要意义。