在世界范围内的恶性肿瘤中,发病率和死亡率最高的是肺癌。据统计,2015年中国肺癌发病及死亡人数分别约为73.33万例和61.02万例,位居全国癌症之首。肺癌的最主要类型为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC),其病情进展快,易复发,预后差。目前,NSCLC的一线化疗方案包括基于铂类的联合疗法和表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)等小分子靶向药物治疗。吉非替尼(Gefitinib,Gef),作为EGFR-TKIs的代表性药物,在临床上得到广泛的应用,尤其是在非吸烟人群和亚洲患者上展现出良好的疗效,为晚期NSCLC患者带来希望的曙光。然而,EGFR-TKIs治疗后出现的获得性耐药导致患者治疗失败,极大地阻碍了其应用。获得性耐药是造成Gef等EGFR TKIs治疗NSCLC不良预后的关键因素,探索其机制以解决耐药问题,进而改善患者的生存状况迫在眉睫。同源异形盒基因(Homeoboxgenes,HOX基因)是一类进化上高度保守的基因,其编码的转录因子在胚胎发育中控制细胞生长和组织分化。近年来研究发现,HOX基因可通过调控肿瘤干细胞的自我更新与肿瘤细胞的增殖、凋亡、细胞周期和侵袭迁移等过程发挥促癌或抑癌作用,一些HOX基因还被证实参与了肿瘤耐药。HOXC6作为HOX家族重要成员之一,被证实在多种肿瘤中异常表达,并可作为恶性肿瘤预测及预后的良好生物标志物。然而,HOXC6在NSCLC肿瘤发生和发展中所起的作用如何,其在NSCLC EGFR-TKIs耐药中扮演怎样的角色,相关研究甚少。microRNA为一类内源性非编码小RNA,可通过作用于相应靶mRNA,参与并控制与肿瘤细胞存亡相关的多种细胞内复杂的生物学进程,影响肿瘤发生发展并调控肿瘤耐药。近年来,许多miRNAs被报道在肺癌发生、复发和转移的过程中以及调节抗肿瘤治疗(尤其是EGFR-TKIs)的应答中发挥着重要的作用。miR-27a和miR-335在胃癌、肝癌、乳腺癌等多种癌症中异常表达,然而,有关miR-27a或miR-335在NSCLC中的表达情况及意义,迄今尚不清楚。此外,研究发现,HOX基因表达也受到多种miRNAs的靶向调节,进而影响肿瘤发生发展及肿瘤耐药。本研究旨在探讨HOXC6在NSCLC Gef敏感性中的作用及其机制,并进一步探究miR-27a/miR-335与HOXC6的靶标关系及其对NSCLC Gef敏感性的影响,以期为NSCLC药物治疗提供新的分子干预靶点,并为临床上逆转耐药的治疗策略提供新的参考。本研究分以下两个部分:第一部分HOXC6对NSCLC吉非替尼敏感性的影响及其机制目的:探究HOXC6在NSCLC的表达情况及在Gef耐药中的作用及其分子机制。方法:1)通过免疫组化技术(IHC)检测93例NSCLC组织芯片中HOXC6的表达情况,并分析HOXC6表达与NSCLC患者临床病理特征及生存期的关系。2)qRT-PCR和Western blot法分别检测NSCLC Gef敏感株(PC9,HCC827)和耐药株(PC9/G,H1299,A549,H1975)中HOXC6的mRNA和蛋白表达水平。3)在PC9/G细胞中转染HOXC6 siRNA后,Western blot检测HOXC6蛋白的表达变化;CCK-8法检测细胞对Gef敏感性的变化,克隆形成实验检测Gef对细胞增殖能力的影响,流式细胞术检测Gef对细胞凋亡和细胞周期的影响,Transwell检测Gef对细胞迁移和侵袭能力的影响。4)在PC9/G细胞中转染HOXC6 siRNA后,Western blot法检测细胞凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭相关蛋白及ABC转运体蛋白的影响。结果:1)HOXC6在NSCLC癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为98.92%和77.01%,差异具有统计学意义(χ2=20.945,P<0.001);HOXC6在NSCLC癌组织中的IHC评分显著高于其在癌旁组织中的评分(6.74±3.11 vs 2.92±1.63,P<0.001);HOXC6高表达与年龄(P=0.015)、淋巴结侵袭(P=0.005)及TNM临床分期(P=0.007)显著相关,而与其他因素无关;Kaplan-Meier分析显示,HOXC6低表达的NSCLC患者的总生存期优于HOXC6高表达患者,两组比较具有统计学差异(P=0.043)。2)与NSCLC Gef 敏感株(PC9,HCC827)相比,NSCLC Gef 耐药株(PC9/G,H1299,A549,H1975)中 HOXC6 的 mRNA 和蛋白表达均显著增强(P<0.05;P<0.05)。3)PC9/G细胞转染HOXC6 siRNA后,HOXC6表达呈剂量依赖性降低;HOXC6沉默后,PC9/G对Gef的敏感性增强,Gef对PC9/G细胞活力和克隆形成能力的抑制明显增强(P<0.01,P<0.001),Gef诱导的细胞凋亡显著增加(P<0.001),细胞发生G2/M期阻滞的比例显著提高(P<0.001),Gef对PC9/G细胞迁移和侵袭能力的抑制作用明显增强(P<0.00l,P<0.001);4)HOXC6沉默后,促存活蛋白Survivin和抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bim表达显著升高(P<0.05);细胞周期调节蛋白Cyclin B1表达升高,CyclinD1表达降低(P<0.05);侵袭转移相关蛋白Akt表达水平降低,GSK3β表达水平升高,β-catenin表达水平降低(P<0.05),Vimentin表达水平保持不变;ABC家族转运蛋白ABCG2、MDR1、MRP1蛋白表达均显著降低(P<0.05),ABCB5蛋白表达水平显著升高(P<0.001)。结论:1)HOXC6在NSCLC癌组织中高表达,可能参与NSCLC发生发展并影响患者生存期。2)HOXC6在NSCLC Gef耐药株中表达增加,HOXC6沉默可能是通过上调Bim,下调Survivin和Bcl-2促进耐药细胞凋亡;调节Cyclin B1和Cyclin D1诱导细胞周期阻滞于G2/M期;抑制Akt/GSK3β/β-catenin信号通路抑制细胞侵袭和转移;调节ABC转运体家族蛋白影响药物的蓄积和释放,从而增强NSCLC细胞对Gef的敏感性。本部分研究阐明了 HOXC6在NSCLC发生发展中的作用以及对Gef耐药的影响及机制,有助于增进我们对NSCLC疾病进展及Gef耐药机制的理解。第二部分miR-27a/miR-335通过靶向HOXC6增强NSCLC吉非替尼敏感性目的:探究 miR-27a/miR-335 与 HOXC6 的靶标关系,以及 miR-27a/miR-335 在 NSCLC Gef敏感性中的作用。方法:1)通过TargetScan等生物信息学预测工具,预测可靶向调节HOXC6的miRNAs;在PC9/G细胞中转染不同miRNA mimics,Western blot法筛选可显著调节HOXC6表达的miRNAs;双荧光素酶报告基因实验验证miR-27a是否作用于HOXC6 mRNA的3’-UTR区预测靶位。2)在PC9/G细胞中转染miR-27a/miR-335 mimics或共转染pcDNA3.1-HOXC6过表达质粒后,CCK-8法检测细胞对Gef敏感性的变化。转染miR-27a/miR-335 mimics后,克隆形成实验检测Gef对细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测Gef对细胞凋亡和细胞周期的影响;Transwell检测Gef对细胞迁移和侵袭能力的影响。3)建立PC9/G细胞裸鼠皮下移植瘤模型(共30只)后,随机分为以下六组(每组 5 只):miR-NC 对照组、miR-27a 组、miR-335 组、miR-NC+Gef 组、miR-27a+Gef组、miR-335+Gef组,分别用相应药物(多点瘤内注射miR-27a/miR-335 Agomir,灌胃给予Gef)干预3周,检测miR-27a/miR-335 Agomir单用或联合Gef给药对肿瘤生长的影响;给药结束后,处死裸鼠,取肿瘤组织固定并进行石蜡包埋,H&E染色检测肿瘤组织形态变化,IHC法测定移植瘤内Ki-67、HOXC6表达情况。4)通过原位杂交技术(ISH)检测93/91例NSCLC组织芯片中miR-27a/miR-335的表达情况,并分析miR-27a/miR-335表达与NSCLC患者临床病理特征及生存期的关系。结果:1)通过TargetScan等生物信息学工具预测可靶向调节HOXC6的miRNAs,并经Western blot检测发现,miR-27a和miR-335可剂量依赖性地下调HOXC6表达;双荧光素酶报告基因实验显示,miR-27a mimics可明显抑制野生型HOXC6 3’-UTR报告基因荧光素酶活性(P<0.01),但不抑制突变型报告基因荧光素酶的荧光活性;HOXC6的3’-UTR区不存在miR-335的结合位点。2)PC9/G细胞转染miR-27a或miR-335 mimics后,Gef对PC9/G细胞活力和克隆形成能力的抑制明显增强(P<0.05,P<0.01;P<0.01,P<0.001),共转染 pcDNA3.1-HOXC6 可抑制 miR-27a/miR-335 对 Gef 的增敏效果(P<0.05,P<0.01)。此外,miR-27a和miR-335过表达可使Gef诱导的细胞凋亡显著增加(P<0.001,P<0.01),G2/M期阻滞的细胞比例显著提高(P<0.01,P<0.001),Gef对PC9/G细胞迁移和侵袭能力的抑制明显增强(P<0.001,P<0.001;P<0.01,P<0.001)。3)miR-27a 或 miR-335 Agomir 均可显著增强 Gef 对移植瘤小鼠肿瘤生长的抑制(P<0.001,P<0.001)。免疫组化HOXC6染色结果显示,miR-27a和miR-335 Agomir单用及联合Gef组HOXC6的表达均明显降低。H&E染色和Ki-67染色结果表明,miR-27a和miR-335 Agomir可增强Gef对肿瘤细胞增殖的抑制。4)miR-27a在NSCLC癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为6.45%和52.87%,两者具有显著差异(χ2=47.153,P<0.001);miR-335在NSCLC癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为53.85%和89.53%,两者具有显著差异(χ2=27.456,P<0.001);miR-27a和miR-335在NSCLC癌组织中的IHC评分均显著低于癌旁组织(0.68±0.56 vs 2.02±1.61,P<0.001;1.68± 1.05 vs 2.86±1.47,P<0.001);miR-27a 低表达与性别(P=0.047)、淋巴结侵袭(P=0.042)、TNM 临床分期(P=0.043)显著相关,miR-335低表达与TNM临床分期(P=0.028)显著相关,而与其他因素无关;Kaplan-Meier分析显示,miR-27a/miR-335高表达患者的总生存期显著优于miR-27a/miR-335低表达患者(P=0.019;P=0.000)。结论:1)miR-27a直接靶向HOXC6启动子3’-UTR区,miR-335间接靶向HOXC6,二者均可显著下调HOXC6表达;2)miR-27a或miR-335过表达可通过增强Gef诱导的PC9/G细胞凋亡、周期阻滞、迁移和侵袭抑制,增强PC9/G对Gef敏感性;3)miR-27a或miR-335可通过抑制HOXC6的表达,增强Gef对移植瘤裸鼠肿瘤生长的抑制。4)miR-27a和miR-335在NSCLC组织中低表达,可能影响NSCLC的发生发展及患者生存期。本部分研究阐明了 miR-27a/miR-335对HOXC6的靶向调节作用及其对Gef耐药的影响,将有助于为NSCLC患者辅助靶向治疗提供新的前景。