研究背景:卵巢癌是妇科常见的生殖系统恶性肿瘤之一,发病率仅次于宫颈癌和子宫体恶性肿瘤,在所有妇科恶性肿瘤中,卵巢上皮性癌致死率位居首位。组织学上,卵巢癌分为上皮性肿瘤、生殖细胞肿瘤、性索-间质肿瘤和转移性肿瘤四大类。临床上,卵巢癌常因症状不典型,缺乏可靠、敏感的标志物而造成早期诊断不足。目前卵巢癌的治疗包括手术、化疗以及放疗等综合治疗。对于大多数晚期肿瘤患者,肿瘤细胞减灭术加以化疗是最适宜的常规治疗方案,但由于卵巢癌病例往往发现较晚,且伴随多处转移,所以手术治疗效果并不理想。而化疗患者至少80%最终出现耐药,耐药的产生直接影响化疗效果及生存率。放射疗法由于其对生育的影响,价值有限,只能对复发患者选用姑息性局部治疗。而基于免疫检查点的治疗方法尚在研究和开发中。总体来说,卵巢癌的5年生存率徘徊在45%左右。对癌症患者进行下一代测序发现,约10%的卵巢癌与BRCA1和BRCA2基因的遗传突变有关。奥拉帕尼是美国食品药品监督管理局批准的一种靶向治疗BRCA基因的胚系突变的晚期卵巢癌的药物,用于治疗此前已接受过三线或三线以上化学药物治疗的病人。奥拉帕尼是一种多ADP核糖聚合酶(poly ADP ribose polymerase,PARP)抑制剂,可以特异性地抑制PARP,阻断DNA修复进程。BRCA突变的卵巢癌表现出对PARP的依赖性增加,因此容易受到PARP抑制的破坏。早期临床试验显示,BRCA突变的卵巢癌患者对奥拉帕尼具有显著的良好应答。然而,相当比例的靶向治疗患者由于未知机制而存在着对奥拉帕尼治疗的耐药性。此外,与大多数靶向抗肿瘤药物一样,我们观察到了奥拉帕尼治疗过程中出现的耐药性。因此,更好地了解该药物产生耐药性的分子机制,寻找潜在可以克服奥拉帕尼耐药的化合物,是目前该靶向治疗药物临床应用亟待解决的问题。MAPK通路是生物体内重要的信号转导系统之一,参与调节细胞的生长、增殖、分化及恶性转化等生物学效应。MAPK通路异常活化常与多种人类恶性肿瘤耐药相关。在此项研究中,我们试图去了解MAPK信号通路是否与卵巢癌奥拉帕尼耐药相关,以及耐药机制,寻找恰当的联合治疗方法,从而克服卵巢癌患者对奥拉帕尼的耐药性。具体包括第一部分:MAPKs抑制剂逆转卵巢癌细胞奥拉帕尼耐药性的体外研究研究目的:1.构建可以对奥拉帕尼产生耐药性的卵巢癌细胞系,便于实验的开展;2.探讨在奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞中MAPK通路相关分子P38和JNK的表达变化;3.探讨MAPKs抑制剂对奥拉帕尼耐药性卵巢癌细胞的增殖、侵袭、自噬和上皮-间充质转变的影响;研究方法:1.对SKOV3和A2780细胞株使用不同浓度的奥拉帕尼进行处理,利用MTT实验法检测不同时间点奥拉帕尼处理后卵巢癌细胞的活力;同时结合Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒对不同卵巢癌细胞系增殖状况进行检测。2.利用Western-blotting法检测奥拉帕尼敏感以及耐药的卵巢癌细胞中,MAPK通路相关分子P38、JNK、ERK和ERK5的表达,以探究MAPK信号通路是否参与卵巢癌耐药性的发生。3.利用CCK-8试剂盒,检测MAPK通路中P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125对卵巢癌耐药细胞进行单独处理或联合使用后,对卵巢癌耐药细胞增殖的影响。4.利用Transwell小室进行侵袭实验,观察P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125对卵巢癌耐药细胞进行联合处理后,对奥拉帕尼耐药性卵巢癌细胞侵袭的影响。5.利用GFP-LC3对细胞进行转染法,对经P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125联合处理的卵巢癌耐药细胞的自噬过程采用western blotting和共聚焦显微镜进行检测。6.使用Western-blotting法,对经P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125联合处理的卵巢癌耐药细胞中上皮细胞-间充质转化的标志物N-CADHERIN,α-SMA的表达进行检测。研究结果:1.成功构建出奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞株:SKOV3-R和A2780-R。利用MTT法检测发现奥拉帕尼对耐药型A2780-R细胞的半抑制浓度(IC50)由亲代A2780-P细胞的16±5μM增加到415±12μM。而耐药型SKOV3-R细胞的IC50值则由亲代SKOV3-P细胞的25±17 增加到688 ±22 μM。表明奥拉帕尼对耐受细胞系活力影响较亲代细胞减少。采用CCK-8法检测奥拉帕尼处理后不同细胞系的增殖状况,发现随着细胞培养天数的增加,奥拉帕尼的处理会显著抑制亲代SKOV3-P和A2780-P细胞系的增殖(P<0.05),对耐受细胞系并不造成影响。结合MTT实验,可以确定成功构建出奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞株。2.Western-blotting法测定奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞中MAPKs通路相关分子的表达通过对奥拉帕尼耐受的A2780-R细胞系与亲代敏感细胞系A2780-P中MAPK信号通路相关分子的表达变化进行比较,可以发现在A2780-R细胞中P38与JNK分子表达明显增加(P<0.05),但ERK和ERK5未见明显改变。表明MAPK信号通路可能参与卵巢癌A2780-R细胞对奥拉帕尼的耐药性中。同时,我们也对SKOV3-R细胞系与亲代敏感细胞系SKOV3-P中MAPK信号通路相关分子的表达变化进行分析,同样发现A2780-R细胞中P38与JNK分子表达明显增加(P<0.05),但ERK和ERK5未见明显改变。表明MAPK信号通路可能参与卵巢癌SKOV3-R细胞对奥拉帕尼的耐药性。3.MAPKs通路P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125对卵巢癌耐药细胞增殖的影响我们使用0μM,5 μM,10 和20 的不同浓度梯度的P38特异性抑制剂SB202190或JNK特异性抑制剂SP600125分别对奥拉帕尼耐药的两种细胞系A2780-R和SKOV3-R进行培养,检测不同时间点的细胞增殖状态,从而确定出两种抑制剂对细胞增殖抑制的最佳作用浓度为10 μM。单独使用SB202190或SP600125对A2780-R和SKOV3-R细胞的生长均有一定的抑制作用,但两种抑制剂的联合使用对细胞的增殖有显著的协同抑制作用(P<0.05)。4.MAPKs通路P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合处理对卵巢癌耐药细胞侵袭的影响通过Transwell小室法进行侵袭实验,显微镜下观察经过P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合处理后的卵巢癌耐药细系A2780-R和SKOV3-R侵袭细胞数目。发现SB202190和SP600125联合治疗组的卵巢癌耐药细胞的侵袭数目明显少于未处理的对照组细胞。表明SB202190和SP600125联合治疗显著降低了奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞的侵袭能力。5.MAPKs通路P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合处理对卵巢癌耐药细胞的自噬通量的影响将GFP标记的LC3转染到奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞系A2780-R和SKOV3-R中,使用Western-blotting检测在P38特异性抑制剂 SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合治疗后耐药细胞系中LC3-磷脂酰乙醇胺偶联物(LC3-Ⅱ)的表达,发现联合治疗较未治疗的对照组会增强LC3-Ⅱ的表达。利用荧光显微镜下观察GFP标记LC3的自噬点结构,发现联合治疗后的卵巢癌耐药肿瘤细胞较对照组细胞存在更多的自噬点结构(P<0.05)。这些结果表明P38和JNK抑制剂的联合治疗会增加奥拉帕尼耐药的A2780-R和SKOV3-R细胞中的自噬通量。6.MAPKs通路P3 8特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合处理对卵巢癌耐药细胞中上皮细胞-间充质转化进程的影响利用Western blotting法,对经P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125联合处理的卵巢癌耐药细胞中上皮细胞-间充质转化的标志物N-CADHERIN,a-SMA的表达进行检测。发现SB202190和SP600125的联合处理,会显著降低耐药细胞中N-CADHERIN和α-SMA的表达,表明SB202190和SP600125的联合作用会抑制奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞系A2780-R和SKOV3-R中的上皮细胞-间充质转化进程。研究结论:实验中成功构建了奥拉帕尼耐药卵巢癌细胞系SKOV3-R和A2780-R,耐药细胞中MAPKs信号通路中P38和JNK的表达均上调。使用MAPKs信号通路中P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合处理可抑制奥拉帕尼耐药卵巢癌细胞系SKOV3-R和A2780-R的增殖、侵袭和上皮细胞-间充质转化进程,增加奥拉帕尼耐药卵巢癌细胞系的自噬。第二部分:MAPKs抑制剂逆转卵巢癌细胞奥拉帕尼耐药性的体内研究研究目的:1.建立裸鼠的卵巢癌移植瘤模型;2.探讨MAPKs抑制剂处理对奥拉帕尼耐药的卵巢癌细胞体内增殖的影响。研究方法:使用胰蛋白酶消化SKOV3-R细胞系,制备重悬于HEPES中的肿瘤单细胞悬液(107个细胞/mL)。取100 μL该细胞悬液与等量的基底膜提取物在冰上充分混合,随后混合物接种到4-6周裸鼠一侧协腹部皮下。实验组小鼠使用MAPKs通路P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125进行腹腔注射治疗,对照组注射等量生理盐水。每5天观察小鼠肿瘤生长状况并测量肿瘤长度与宽度,根据肿瘤体积的计算公式:体积(mm3)=(宽度)2(mm2)×长度(mm)/2,统计出不同时间点下的肿瘤体积,从而建立卵巢癌裸鼠的移植瘤模型,并观察MAPKs通路抑制剂SB202190和SP600125对奥拉帕尼耐药的SKOV3-R细胞系是否会有体内的增殖抑制作用。与此同时,我们也采取了相同的方法构建了裸鼠A2780-R卵巢癌肿瘤模型,以期评价MAPKs通路抑制剂SB202190和SP600125对奥拉帕尼耐药的A2780-R细胞系是否也存在体内的增殖抑制作用。研究结果:裸鼠在接种奥拉帕尼耐药卵巢癌细胞系A2780-R和SKOV3-R后,活动反应正常,肿瘤一般在2周左右开始出现,对肿瘤的形态进行观察,可以发现卵巢癌细胞系A2780-R和SKOV3-R构建的移植瘤形态较为规则,质地较为坚硬。对A2780-R细胞系构建的移植瘤进行分析,可以发现:在15天时,使用P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125进行联合处理的小鼠,其肿瘤体积与对照小鼠相比开始出现降低趋势。随着疾病的进展,在第30天时进行观察,与对照组相比,SB202190和SP600125的联合处理组小鼠肿瘤体积约为350 mm3,对照组小鼠肿瘤体积则约为800 mm3,二者之间存在显著性差异(P<0.05)。这表明,MAPKs通路抑制剂SB202190和SP600125对奥拉帕尼耐药的A2780-R细胞系也具有体内的增殖抑制作用,这与体外实验的结果相一致。同时,我们也对SKOV3-R细胞系构建的移植瘤进行分析,可以发现:在15天时,P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合处理组小鼠的肿瘤体积较对照鼠也开始出现增长放缓趋势。随着疾病的进展,在第30天时进行观察,与对照组相比,SB202190和SP600125的联合处理组小鼠肿瘤体积约为400 mm3,对照组小鼠肿瘤体积则接近1000 mm3,二者之间差异非常显著(P<0.05)。这表明,MAPKs通路抑制剂SB202190和SP600125对奥拉帕尼耐药的SKOV3-R细胞系同样也具有很好的体内增殖抑制作用,会显著抑制肿瘤的生长。这些结果提示我们MAPKs抑制剂对奥拉帕尼耐药的卵巢癌具有很好的治疗作用。研究结论:MAPKs信号通路中P38特异性抑制剂SB202190和JNK特异性抑制剂SP600125的联合处理可在小鼠体内抑制奥拉帕尼耐药卵巢癌细胞系SKOV3-R和A2780-R的增殖,具有重要的抗肿瘤活性。