刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种呈世界性分布的专性细胞内寄生原虫，可寄生在除红细胞外的几乎所有有核细胞中，引起人兽共患的弓形虫病。弓形虫是一种机会性致病原虫，机体免疫功能正常者感染弓形虫一般没有明显症状，为隐性感染状态。但对于免疫功能受损或缺陷者，如肿瘤病人，AIDS患者等，弓形虫在患者体内可以大量增殖，引起全身播散性损害，严重者可导致死亡。此外，妊娠期感染弓形虫可通过胎盘垂直传播，引起早产、流产、死胎、畸胎或婴儿发育畸形等。近年来，由于艾滋病的广泛流行和宠物饲养的逐渐增多，弓形虫的危害也日益突出，弓形虫感染成为一个严重的公共卫生问题。弓形虫速殖子与缓殖子的相互转化，是弓形虫致病的中心环节。速殖子可引起宿主的急性感染，而包囊内的缓殖子是形成慢性感染的主要形式，弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的机制尚不清楚。目前弓形虫病的治疗尚无特效药物，主要以乙胺嘧啶，乙酰螺旋霉素等药物为主，这些药物对速殖子有杀灭、抑制作用，而对包囊内的缓殖子几乎没有作用。但包囊内缓殖子的活化，能对宿主造成极大的危害。因此，探讨弓形虫速殖子与缓殖子相互转换机制的研究成为弓形虫病研究的热点和难点之一。近年来，以RNA干扰和转基因技术为基础的反向遗传学的发展，为我们提供了一个从基因变化分析基因功能的方法。本研究综合目前弓形虫速殖子与缓殖子相互转化的研究现状及研究中存在的主要问题，采用Transgenesis、RNAi和Reverse genetics的原理和方法，建立弓形虫RH株速殖子与缓殖子体外相互转化的细胞模型，克隆转化早期差显基因的编码序列，构建弓形虫热休克蛋白70（HSP70）基因启动子驱动的反向重复序列RNAi载体系统，建立一套进行弓形虫基因功能分析的Reverse Genetics技术平台，并选取在速殖子向缓殖子转化早期开始表达的基因进行重点分析，以阐明这些分子在速殖子向缓殖子转化过程中的功能与作用。一、弓形虫体外速殖子与缓殖子相互转化模型的建立小鼠腹腔接种弓形虫RH株速殖子，3-4天后收集小鼠腹腔液，用国产4.5号针头注射器反复抽吸虫体悬液破裂宿主细胞释放虫体，虫体悬液用孔径3μm的滤膜过滤纯化速殖子，速殖子纯度可达98％以上。将纯化的弓形虫RH株速殖子按照1：10的比例，接种于NIH3T3细胞单层（NIH3T3细胞单层生长达到60％-70％时接种速殖子，培养基含5％新生牛血清），置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养，速殖子增殖迅速，大量破坏宿主细胞，培养5-6天后收集弓形虫速殖子，进行分瓶培养或实验研究。为探索碱性条件下弓形虫速殖子向缓殖子的诱导转化，按照1：10比例将RH株速殖子接种NIH3T3细胞单层，接种4h后，用pH8.1的DMEM培养基轻轻冲洗细胞单层以移去未侵入细胞的弓形虫速殖子，再加入pH8.1的DMEM培养基（含2.5％新生牛血清）置于37℃空气中培养96h。镜下观察可见NIH3T3细胞胞浆中出现大小不等的圆形囊性小体，囊壁折光性较强。收集培养虫体提取总RNA，采用RT-PCR的方法进行缓殖子期特异抗原缓殖子抗原1（BAG1）mRNA的检测，结果得到700bp左右目的条带，PCR产物克隆到T载体后测序，测序结果与已发表的BAG1基因mRNA同源性高达99.3％，无基因组DNA内含子序列，结果表明成功诱导缓殖子的形成。为监测速殖子向缓殖子转化进程，在诱导第0、24、48、72、96小时，分别取出一瓶培养虫体，提取总RNA，以弓形虫β—微管蛋白的mRNA RT—PCR产物为参照，进行半定量RT—PCR扩增BAG1基因mRNA，结果显示，随着诱导时间的延长，BAG1 mRNA的转录水平逐渐提高，表明随着诱导时间的延伸，有更多的弓形虫速殖子转化成缓殖子。为诱导缓殖子向速殖子的转化，将pH8.1碱性条件诱导形成的缓殖子恢复pH7.2培养基及正常培养条件，24h后可见溶液中出现游离弓形虫速殖子，2-3天后速殖子开始大量增殖，需适当补充NIH3T3细胞才能继续培养。为探索热休克对弓形虫速殖子向缓殖子的转化影响，将常规培养的NIH3T3细胞分别放入37℃，39℃，41℃，43℃，5％CO₂培养箱中培养3h后，按照1：10比例接种纯化的RH株速殖子，接种4h后，用相应温度预热的DMEM培养基轻轻冲洗细胞单层，以移去未侵入细胞的弓形虫速殖子后，分别放置在37℃，39℃，41℃，43℃，5％CO₂培养箱中培养48h，收集培养混合物，提取总RNA，进行RT-RCR。结果表明39℃诱导条件下，速殖子增殖较快，不能诱导形成缓殖子，39℃诱导条件还是适于速殖子的生长条件。43℃诱导条件下，NIH3T3宿主细胞难以生长，不能为弓形虫速殖子提供一个稳定的细胞内环境，不利于弓形虫RH株速殖子向缓殖子的转化。41℃诱导条件下，NIH3T3宿主细胞变性坏死相对较慢，能为弓形虫速殖子提供一个相对稳定的细胞内环境，弓形虫RH株速殖子能诱导转化为缓殖子。二、弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统的构建1．弓形虫主要表面抗原1（SAG1）基因启动子驱动的绿色荧光蛋白基因载体的构建：构建该载体的目的是一方面作为转基因弓形虫的一种荧光筛选标志，另一方面作为转基因弓形虫是处于速殖子或缓殖子，还是两者之间中间状态的一种指示。设计引物，通过PCR分别扩增SAG1基因5’UTR启动子序列（SAG1／5UTR）、SAG1基因3’UTR序列（SAG1／3UTR）及绿色荧光蛋白编码序列（eGFP），通过酶切连接，构建弓形虫SAG1基因启动子驱动的绿色荧光蛋白基因载体pBSK-SAG1／5UTR-eGFP-SAG1／3UTR（pBSK-SAG1／GFP），序列测定结果正确。2．弓形虫可诱导的反向重复序列RNAi载体的构建：设计引物，通过PCR分别扩增弓形虫HSP70基因5’UTR启动子序列（HSP70／5UTR）、HSP70基因3’UTR序列（HSP70／3UTR）及β-微管蛋白基因内含子C序列（IntronC），通过酶切连接，构建以弓形虫热休克蛋白HSP70基因启动子进行驱动的，以β-微管蛋白基因内含子C序列作为间隔序列，以HSP70基因3’UTR序列作为转录终止信号的反向重复序列RNAi载体pBSK-HSP70／5UTR-IntronC-HSP70／3UTR，序列测定结果正确。3．弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统的构建：利用载体pHANA-0.5具有弓形虫穿梭载体的功能，将载体pBSK-SAG1／GFP中的SAG1／5UTR-eGFP-SAG1／3UTR片段克隆到载体pBSK-HSP70／5UTR-IntronC-HSP70／3UTR中形成载体pBSK-GFP-Hairpin，再将该载体中的GFP-Hairpin片段克隆到载体pHANA-0.5中形成弓形虫可遗传及可诱导的RNAi载体系统pHANA-hairpin，序列测定结果正确。4．弓形虫SAG1基因RNAi载体的构建：为对弓形虫SAG1基因进行RNAi，设计引物，通过PCR分别扩增SAG1基因的正向和反向序列，通过酶切连接，将正向和反向序列克隆到载体pHANA-hairpin相应酶切位点，构建SAG1基因RNAi载体pHANA-hairpin／SAG1，序列测定结果正确。5．弓形虫BAGl基因RNAi载体的构建：为对弓形虫BAG1基因进行RNAi，设计引物，通过PCR分别扩增BAG1基因的正向和反向序列，通过酶切连接，将正向和反向序列克隆到载体pHANA-hairpin相应酶切位点，构建BAG1基因RNAi载体pHANA-hairpin／BAG1，序列测定结果正确。三、转基因弓形虫品系的建立及RNAi初步研究分别将质粒pHANA-hairpin／SAG1和pHANA-hairpin／BAG1通过电转化导入弓形虫RH株速殖子获得两个转基因弓形虫品系。将1X10⁷弓形虫速殖子和质粒DNA 10μg重悬于800μl电击缓冲液cytomix中。在4mm间隙电穿孔杯中以电压0.4kv，电容800μF电击1次，时间延迟为6-9msec。转染弓形虫培养24h后，在荧光倒置显微镜下观察，两个品系转基因弓形虫均可观察到绿色荧光的表达，分别提取两个品系转基因弓形虫速殖子总RNA，进行RT-PCR，结果均能检测到GFP基因的转录，证明质粒成功导入弓形虫速殖子并进行了表达。将两个品系转基因弓形虫速殖子进行碱性环境（pH8．1）诱导，诱导培养96h后，在荧光倒置显微镜下观察，均可观测到有绿色荧光表达，分别提取两个品系转基因弓形虫诱导后虫体总RNA，进行RT-PCR，结果均能检测到SAG1、BAG1及GFP基因的转录。出现这种现象可能的原因有：1．部分转基因弓形虫速殖子未转化为缓殖子；2．部分转化的转基因弓形虫处于一种速殖子与缓殖子的中间状态，未形成成熟的缓殖子和包囊；3．诱导干扰的SAG1基因或BAG1基因可能对速殖子向缓殖子转化过程有影响，使得转基因弓形虫仍处于速殖子状态，这些问题尚需进一步研究。