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第一部分线粒体Src酪氨酸激酶在离体大鼠心脏缺血预处理(Ischemic Preconditioning,IPC)保护中的作用目的虽然IPC以及其他一些心脏保护干预措施已经被证实通过抑制再灌注期线粒体复合体I的活性而发挥其抗缺血/再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤心肌保护作用,但其调节线粒体复合体I活性的具体机制尚不清楚。本研究的研究目的是证明IPC通过激活线粒体Src酪氨酸激酶调节线粒体复合体I的活性,进而发挥其抗I/R损伤心肌保护作用这一假设。方法为了建立离体大鼠心脏I/R损伤模型,雄性Wistar大鼠经过麻醉后迅速取出心脏置于Langendorff装置上,心脏经历30 min缺血和2 h再灌注。IPC组在长时间缺血之前经历3个循环的5 min缺血和5 min再灌注。TTC染色法测定心肌梗死面积。用Western blotting法检测线粒体Src酪氨酸激酶Tyr416位点的磷酸化水平以检测酶的活性。用复合体I活性微量检测试剂盒检测线粒体复合体I的活性。用免疫共沉淀法检测线粒体Src酪氨酸激酶是否与复合体I存在相互作用。结果与对照组相比,IPC明显减小离体大鼠心脏的梗死面积,但是此作用被酪氨酸激酶选择性抑制剂PP2(1μM)抑制。Western blotting结果显示,缺血30 min及再灌注10 min后线粒体Src酪氨酸激酶的Tyr416位点的磷酸化明显减少。IPC可提高再灌注开始时线粒体Src酪氨酸激酶的磷酸化水平,但是此作用被酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮(Genistein)所逆转。与上述结果一致,IPC的抗I/R损伤作用也被酪氨酸激酶选择性抑制剂PP2所抑制。另外,IPC通过激活Src酪氨酸激酶抑制再灌注时复合体I的活性。进一步的研究发现,复合体I与Src以及磷酸化Src发生共沉淀。IPC诱导复合体I UDUFS3亚单位蛋白酪氨酸的磷酸化,说明UDUFS3亚单位的蛋白酪氨酸磷酸化可能与IPC对复合体I的抑制作用有关。结论IPC通过激活线粒体Src酪氨酸激酶而抑制线粒体复合体I的活性,进而保护缺血再灌注的心脏。第二部分锌离子转运体Zip2在缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)损伤中的重要作用目的外源性锌离子可保护心肌,但内源性锌离子及其稳态在心肌I/R损伤中的作用尚不清楚。Zip2是一种锌离子内向转运蛋白,它通过锌离子的内向转运来增加细胞内锌离子的浓度。本研究的目的是探讨Zip2在H/R损伤中的作用及其表达的调控机制。方法置大鼠心房来源的H9c2细胞于缺氧液中,并在缺氧(1%O2)环境下培养21 h,然后换成正常的DMEM培养基,在含5%CO2孵箱中培养4 h,诱导H/R损伤,用实时荧光定量PCR检测Zip2,STAT3的基因表达水平。培养正常H9c2细胞,用Zip2质粒,Zip2-si RNA,Stat3-si RNA进行转染。所有实验在转染48 h后,用Fluo Zin-3检测细胞内游离锌离子浓度,利用碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)检测细胞存活率。结果心肌细胞内游离锌离子浓度在H/R后明显降低(66.4±4.7%,P<0.05),表明H/R会引起心肌细胞内锌离子的丢失。实时荧光定量PCR结果显示,H/R后Zip2基因表达水平明显升高(5倍),提示细胞通过增加Zip的方式补偿H/R所引起锌离子的大量丢失。为了探讨Zip2在H/R损伤中的作用,我们利用基因调控技术改变Zip2基因的表达水平来观察Zip2基因的不同表达水平对细胞存活率的影响。与正常细胞相比,H/R使细胞存活率降至73.7±1.7%(P<0.05)。转染Zip2 si RNA后,细胞存活率进一步降至57.7±2.3%(P<0.05),而转染Zip2质粒后细胞存活率增高至83.5±2.9%(P<0.05)。以上结果表明Zip2在H/R损伤中具有细胞保护作用。信号转导活化转录因子-3(Signal Transducers and Activators of Transcription-3,STAT3)的抑制剂Stattic也逆转H/R后Zip2基因表达水平的升高,表明STAT3可能参与复氧后Zip2基因的上调。H/R及锌离子螯合剂TPEN增加STAT3的Tyr705位点的磷酸化,表明H/R时锌离子的丢失引起STAT3的激活。另外,Stattic也降低H/R后细胞的存活率,进一步说明STAT3的作用。结论复氧后锌离子的丢失通过激活STAT3而诱导Zip2的基因表达,这可能是细胞对抗H/R损伤的重要的内源性保护机制。