防治哈密瓜细菌性果斑病拮抗酵母菌的筛选及其生防机理研究

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由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)引起的哈密瓜果斑病(Bacterial fruit blotch,BFB)是瓜类生产中一种毁灭性细菌性病害。目前在瓜类作物中无免疫品种。虽然化学防治对该病有一定的防治效果,但是大量使用化学杀菌剂往往会造成环境污染、农药残留,以及引起病原菌抗药性等问题。生物防治被认为是一种合理而又安全的防治手段。探讨利用酵母菌防治哈密瓜细菌性果斑病是非常必要的。本论文从拮抗酵母菌的筛选、防效评估、拮抗酵母菌菌株的鉴定、发酵体系、抑菌物质的理化性质、以及抑菌机理等方面进行了系统研究,获得如下研究结果:1、从湖北武汉、河南信阳和新疆石河子采集的植物和土壤等样品中分离获得463株酵母菌。经过平板抗生性测定和盆栽活体试验,成功筛选出一株有效防治哈密瓜细菌性果斑病的拮抗酵母菌菌株0732-1。2、在温室试验中,用酵母菌0732-1发酵液处理带菌哈密瓜种子,能显著降低Aac对哈密瓜幼苗的侵染。在第一次试验中,使用0732-1、农用链霉素和盐酸处理带菌种子的发病率分别为2.8%、0和2.6%,对照发病率为97.6%。在第二次试验中,发病率分别是7%、8.8%和3.7%,对照发病率为83.3%。两次试验中防病效果三者间无显著差异(P>0.05)。在田间试验中,酵母菌0732-1发酵液(1×10~7cfu/ml或1×10~9cfu/ml)能有效降低哈密瓜细菌性果斑病的危害。另外,酵母菌0732-1先于Aac接种的防效优于同时接种酵母菌和Aac的防效。在哈密瓜幼苗灌根施用中,酵母菌0732-1无显著防病和促生的效果。3、根据形态特征、营养代谢特征、生理生化特性、以及ITS-5.8S rDNA片段序列分析(GenBank数据库中登录号为EU380207),将酵母菌0732-1鉴定为Pichiaanomala。4、酵母菌0732-1能利用8种碳源(蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、柠檬酸钠、乳糖、甘油和乙醇)和6种氮源(硫酸铵、硝酸铵、尿素、磷酸二氢铵、硝酸钾、蛋白胨)进行生长和繁殖,并能产生抑制Aac的抗细菌物质(antibacterial substances,ABS)。其中6种碳源(果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乙醇和甘油)和4种氮源(硫酸铵、磷酸二氢铵、硝酸钾和蛋白胨)适于产生ABS。最适碳源为果糖。磷酸二氢钾(29.39 mmol/L)有利于酵母菌0732-1产生ABS。5、酵母菌0732-1抑菌谱广,对供试17种真菌和4种细菌具有抑制效果,其中6种真菌和1种细菌(Aac)是侵染瓜类植物的病原菌。因而,此酵母菌具有防治多种瓜类植物病害的潜质。6、通过单因素试验对酵母菌0732-1产生ABS的条件进行了研究。试验结果表明:酵母菌0732-1产生ABS的最适环境条件是:初始pH值为9.0;装样量为80 ml(250 ml三角瓶);接种量为10%;温度20℃;培养96 h后,发酵液中的ABS抑菌活性达到最大。7、酵母菌0732-1产生的ABS可能是一类耐热、耐酸、抗紫外线的非蛋白极性物质。当环境pH高于9.0时,抑菌活性完全丧失。采用硫酸铵分级沉淀和有机溶剂萃取不能从发酵液中分离出ABS。利用蒸馏法可以得到部分ABS。8、试验证实:酵母菌0732-1的防病机制包括抗生作用和诱导寄主抗性。酵母菌0732-1在培养过程中能产生大量的ABS,并能对Aac具有明显抑菌作用;施用该菌及其发酵物均能提高哈密瓜幼苗体内3种防卫反应相关酶(POD、PAL和CAT)的产生。同时还发现酵母菌0732-1在大田条件下,能迅速定殖于哈密瓜叶片和果实表面上。在瓜叶上接种15 d后,种群为1.2×10~5cfu/cm~2;在哈密瓜幼果上接种10 d后,种群数量为1×10~7cfu/cm~2。虽有下降,但趋势波动不大。上述研究结果为进一步开发利用酵母菌0732-1防治哈密瓜细菌性果斑病奠定了基础。
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