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MTMR14(myotubularin related protein 14)是我们前期基于GEO数据库肝癌测序数据,筛选到的新的肝颈癌预后标志物之一,其编码了肌微管素相关的一种蛋白质,这种蛋白质本质上是一种磷酸肌醇磷酸酶,具有对3,5二磷酸磷酸肌醇以及3磷酸肌醇的特异性磷酸键水解作用。通过qRT-PCR和IHC实验证实,MTMR14在肝癌组织中显著高表达,提示MTMR14可能在肝癌中扮演了“促癌“的角色。目前,MTMR14在肝癌中的生物学功能及其分子机制尚未见研究报道,因此我们以肝癌细胞为研究模型,重点研究了MTMR14在肝癌细胞增殖、凋亡,周期、侵袭等生物学功能中的作用,并阐明其发挥功能的分子生物学机制。第一部分MTMR14在肝癌中的表达及临床意义分析目的:基于GEO和TCGA数据库中肝癌测序数据和临床资料,深入挖掘肝癌预后相关的靶基因。随后分析MTMR14在肝癌组织中表达水平,及其与肝癌患者临床病理参数的关系。方法:运用生物信息学方法在GEO数据库中下载肝癌血管转移相关的基因表达谱数据,基于病人的临床详细信息,将数据分为肝癌血运远处转移组和肝癌血运未远处转移组,分析在肝癌血运转移患者中异常表达的基因;然后对差异基因进行基因本体富集、Pathway富集分析及差异基因间共表达网络分析,并后续通过q-PCR及免疫组化进行验证。结果:生信分析提示MTMR14在肝癌组织中高表达,且功能被富集到代谢,凋亡相关中。我们通过免疫组化和q-PCR给予了验证,MTMR14在肝癌组织中明显高表达,并且和生存预后相关。MTMR14在早期肝癌中表达高于晚期肝癌(P<0.05),但和年龄,性别以及肿瘤大小无关(P>0.05).结论:MTMR14是我们最新鉴定的肝癌预后标志物之一,其在肝癌组织中异常高表达,且其表达量与肝癌患者的临床特征存在相关性。第二部分MTMR14在肝癌细胞中的作用目的:检测MTMR14对肝癌细胞HuH7和HepG2的增殖、周期、克隆形成及侵袭能力、凋亡的影响;裸鼠体内成瘤实验检测沉默MTMR14后对肝癌迁徙能力的影响。方法:采用siRNA沉默MTMR14表达后,流式细胞技术、CCK-8和transwell等分别检测细胞周期、凋亡、增殖和侵袭能力,利用慢病毒合成低表达MTMR14稳转株后,裸鼠成瘤实验检测MTMR14对细胞体内迁徙能力的影响。结果:沉默MTMR14以后,显著诱导肝癌细胞发生凋亡并减轻其迁徙能力(P<0.05)。但并不明显影响细胞周期,增殖,侵袭能力(P>0.05)。在裸鼠体内成瘤实验同样表明,低表达MTMR14以后可以减轻细胞迁徙能力。结论:MTMR14同时参与了肝癌细胞的迁徙与凋亡,提示其在肿瘤的发生发展中可能具有重要的作用。第三部分MTMR14诱导内质网应激并调控肝癌细胞凋亡及自噬的分子机制研究目的:证明沉默MTMR14在肝癌细胞中也能促进自噬,阐明MTMR14能够同时诱导凋亡和自噬的相关机制,初步研究MTMR14影响细胞迁徙能力的机制。方法:沉默MTMR14以后利用蛋白质免疫印迹检测自噬相关标记蛋白,激光共聚焦显微镜观察自噬流,透射电镜观察自噬泡研究MTMR14诱导并参与了肝癌细胞自噬。利用流式细胞仪,蛋白质免疫印迹等技术检测内质网应激相关标记蛋白和钙离子。利用蛋白质免疫技术研究凋亡和自噬,迁徙相关通路蛋白。结果:West-blot技术,激光共聚焦显微镜技术及透射电镜结果均支持沉默MTMR14以后能够诱导肝癌细胞自噬。流式细胞术提示细胞内钙离子浓度升高明显(P<0.05),抑制自噬以后再沉默MTMR14能够更加促进凋亡,荧光显微镜结果提示3MA+siRNA组的线粒体膜电位下降更加明显。West-blot技术表明沉默MTMR14以后ATF6,DAPK1,Beclin1上调以及E-Cadherin和N-Cadherin下调,Caspase12,9,3出现活化切割,而Caspase8不变。结论:沉默MTMR14能够同时诱导自噬和凋亡,其机制可能通过钙离子失衡/超载诱发内质网应激起作用的。第四部分初步探讨MTMR14与其他蛋白质的相互作用目的:研究MTMR14可能结合的蛋白质,为进一步进行蛋白质组学提供方向。方法:提取肝癌细胞HuH7的总蛋白,通过免疫沉淀,银染,West-blot实验及LC-MS质谱分析得到相关结果。结果:根据质谱结果及软件分析,角蛋白家族/细胞骨架蛋白得分最为靠前。结论:MTMR14可能和角蛋白家族/细胞骨架蛋白组成异二聚体行使相关功能。