论文部分内容阅读
环酰胺水解酶类是生物体内重要的水解酶之一,它们的作用底物尽管各不相同,但作用的化学键都是蛋白或多肽以外的各种有机环中酰胺键。它们大多属于金属依赖性的酶类,活性中心由数个结合二价金属离子的保守残基,即一个天冬氨酸和四个组氨酸残基组成。在空间结构上大多数属于（α/β）8桶结构。在生物体内这些酶常常参与嘧啶和嘌呤类的代谢,这些酶在工业上常用于氨基酸或有机酸的生物转化。根据底物专一性的不同将环酰胺水解酶分为环酰脲和环酰亚胺水解酶两大类型。前者包括了目前常见的海因酶、二氢嘧啶酶、尿囊素酶、二氢乳清酸酶。后者是一类文献报道较少,但在亚基分子量,氨基酸序列,底物谱均明显不同与前者的酶类。 我们对本实验室保存的一株具有水解海因能力的菌株进行了鉴定,并对其中两种不同类型的环酰胺水解酶的基因进行了克隆,表达,纯化以及性质研究。 1.菌株的鉴定 对本实验室自行分离的能水解海因的菌株,进行了形态学观察,生化性质以及16S rDNA序列分析,结果表明该菌株的菌落形态呈杆状,极生单根鞭毛,革兰氏反应为阴性,氧化产酸。16S rDNA序列的比对分析进一步说明该菌株为恶臭假单胞杆菌,为此该菌定名为Pseudomonas Putida YZ 26。 2.D—海因酶的基因克隆,表达,纯化与性质 根据文献报道的D—海因酶的基因序列和氨基酸序列,设计PCR引物,以该菌基因组DNA为模板,经PCR扩增获得Pseudomonasputida YZ-26的D—海因酶基因。DNA序列分析表明,该基因全长1440bp,编码479aa,计算分子量为52kD,基因序列已在GenBank中登录（AY387829）,将推导的氨基酸序列进行BLAST比对,同Pseudomonas putida CCRC12857的同源性最高,为90.1%。D—海因酶基因分别克隆到不同的表达载体中（如pET3a,pET32M,pGEX-4T-1,pET28a）中,并在大肠杆菌BL21中表达,目