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植酸酶是一种重要的工业用酶,被广泛的用作单胃动物的饲料添加剂,它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。但目前热稳定性差及酶活力低是植酸酶在生产应用中的一个瓶颈,因此通过蛋白质工程技术对植酸酶基因进行改造具有重要的科研和实用价值。本研究采用反向长距离PCR技术对来源于黑曲霉N25的植酸酶phyAm基因进行定点突变,即将植酸酶44位的异亮氨酸(ATC)替换为谷氨酸(GAA) (I44E),将252位的苏氨酸(ACC)替换为精氨酸(AGA) (T252R), I44E、T252R密码子替换均选用毕赤酵母偏爱密码子,并构建了三个重组质粒pPIC9k-phyA44、pPIC9k-phyA252及pPIC9k-phyA44-252。将重组质粒线性化后电击转化巴斯德毕赤酵母,经筛选获得了突变植酸酶毕赤酵母基因工程菌株PP-NPm-44、PP-NPm-252及PP-NPm-44-252。将未突变和突变植酸酶毕赤酵母基因工程菌株经BMGY/BMMY诱导培养,并对表达产物进行了分离纯化及酶学性质研究。结果表明：(1)表达产物的SDS-PAGE分析表明,突变和未突变植酸酶的大小一致,均为70.15kD。(2)突变前后植酸酶的最适反应温度和最适反应pH未发生变化,分别为55℃和pH5.0。(3)突变体PP-NPm-44、PP-NPm-252及PP-NPm-44-252经BMGY/BMMY诱导培养4d,其酶活力分别达到70293 U/mL、72647 U/mL和81227 U/mL,分别是出发菌株PP-NPm-8(63667 U/mL)的1.1、1.14和1.28倍,比活力分别是出发菌株的1.09、1.04和1.27倍。(4)热稳定性研究结果表明：三个突变体的热稳定性均有所提高,且突变体PP-NPm-44-252具有最好的热稳定性,分别在80℃和90℃处理10min后,突变植酸酶的剩余酶活力比未突变植酸酶提高了约36%和47%,酶蛋白解链温度提高了1.2℃。(5)金属离子对酶活力的影响研究表明：Cu2+、Zn2+、Ag+、SDS有一定的抑制作用,尤其是Cu2+可使酶活力降至46.24%;Mg2+、Mn2+、Co2+对植酸酶有明显的激活作用,而大多数金属离子对植酸酶活力影响不大。本研究通过定点突变技术,获得了在毕赤酵母中高效表达且热稳定性良好的植酸酶基因工程菌株,并通过对突变前后植酸酶结构预测分析探讨了植酸酶结构与功能关系,为进一步改造植酸酶基因和植酸酶基因工程菌投入生产奠定坚实基础。