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目的:糖尿病睾丸功能障碍是糖尿病男性生殖系统重要的并发症,对男性的心理健康与生殖功能造成一定的影响。然而关于糖尿病睾丸功能障碍发生与发展的机制尚不明确。簇集蛋白（Clusterin,CLU）又称为载脂蛋白J,在机体中主要由星形胶质细胞分泌,Clusterin与多种肿瘤的发生、发展以及转移等进程相关。近些年研究发现Clusterin与糖尿病发展进程有着密切关系,有报道指出Clusterin与2型糖尿病的发病率有关,且可参与包括糖尿病脑梗死在内的多种危重疾病,但其在糖尿病睾丸功能障碍中还未见系统报道。因此,本研究主要以Clusterin为研究导向,以糖尿病睾丸功能障碍为研究媒介,以明确Clusterin在糖尿病睾丸损伤中的生物学功能,并建立以Clusterin为核心,以METTL3为上游调控因子,通过介导Lnc RNA TUG1-Clusterin信号轴激活PI3K/AKT/m TOR信号通路及其介导的自噬进而抑制糖尿病睾丸损伤的调控网络,为糖尿病睾丸损伤发生与进展挖掘新机制,从而为糖尿病睾丸功能障碍治疗寻找新的作用靶点。方法:构建STZ诱导的糖尿病大鼠模型,转染Clusterin、METTL3、Lnc RNA TUG1过表达载体,以及LY294002处理,ELISA检测糖尿病大鼠血清中睾酮水平,IHC检测糖尿病大鼠睾丸组织中METTL3表达水平,HE染色检测糖尿病大鼠睾丸组织损伤情况,TUNEL检测睾丸组织细胞凋亡,q RT-PCR与WB检测Clusterin、METTL3、Lnc RNA TUG1、自噬相关蛋白（LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、p62）以及凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9）表达等。构建高糖诱导的GC-1 spg细胞损伤模型,转染Clusterin、METTL3、Lnc RNA TUG1、Clusterin过表达和SRSF1沉默载体,此外,用自噬激活剂雷帕霉素和PI3K抑制剂LY294002处理细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,自噬流检测、免疫荧光检测Clusterin和METTL3蛋白表达,q RT-PCR与WB检测Clusterin、Lnc RNA TUG1、自噬相关蛋白（LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1、p62）、凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9）以及PI3K/Akt/m TOR信号通路（PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、m TOR、p-m TOR）表达,RNA稳定性检测Clusterin mRNA稳定性,RIP与RNA pull-down检测TUG1与Clusterin以及METTL3与TUG1相互作用关系等研究方法。结果:一、Clusterin对糖尿病诱导的睾丸损伤过程中自噬和凋亡的影响:首先ELISA检测发现STZ诱导的大鼠血清中睾酮水平明显低于对照组,IHC结果表明,糖尿病大鼠睾丸组织中Clusterin表达显著低于对照组,而LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的比值显著高于对照组。WB进一步证实与对照组相比,Clusterin表达显著下调,而LC3表达显著上调,免疫荧光检测显示,高糖诱导后,Clusterin在细胞核和细胞浆中的表达显著下调。此外,高糖诱导后,GC-1 spg细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高,凋亡相关蛋白（Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9）表达显著上调,而Bcl-2蛋白表达显著下调,自噬相关蛋白LC3和Beclin-1表达均上调,而p62表达显著下调。自噬流检测发现,高糖诱导后,自噬体和自噬溶酶体明显增多。过表达Clusterin后可恢复上述指数,而添加雷帕霉素（RAP）处理可削弱Clusterin过表达对上述指标的恢复作用。二、Clusterin通过激活PI3K/AKT/m TOR信号通路调控糖尿病睾丸损伤:WB检测发现,在高糖诱导的GC-1 spg细胞中p-PI3K、p-Akt、p-m TOR水平显著下降,且自噬相关蛋白LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的比值显著上升,Beclin-1表达显著上调,p62表达显著下调,表明高糖可抑制PI3K/AKT/m TOR信号通路激活,也激活了细胞自噬。过表达Clusterin可激活PI3K/AKT/m TOR信号通路,并抑制细胞自噬。而添加PI3K抑制剂LY294002后,过表达Clusterin的结果得到逆转。此外,过表达Clusterin后,STZ大鼠血清中的睾酮水平显著升高。HE染色显示,与对照组相比,STZ大鼠的睾丸组织损伤严重,出现曲细精管的直径变细小,排列不紧密,管腔内空洞化等明显病理改变,且自噬相关蛋白LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的比值明显上升,Beclin-1表达显著上调,p62表达显著下调。此外,TUNEL结果显示,STZ大鼠睾丸组织中生精细胞凋亡数与正常对照组相比明显升高（68.47±2.01vs 3.04±1.79,P＜0.001）。上述指标可被Clusterin过表达所改善,但添加PI3K抑制剂LY294002后可削弱Clusterin过表达的保护作用。三、METTL3增强生精细胞活力,抑制高糖诱导的生精细胞凋亡:高糖GC-1spg细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高,而过表达METTL3后可改善上述结果。在高糖诱导的GC-1 spg细胞中,Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达显著上调,Bcl-2蛋白表达下调,而过表达METTL3后均可逆转上述结果。四、METTL3通过TUG1结合SRSF1,增强Clusterin的稳定性抑制高糖诱导的生精细胞凋亡:在高糖诱导的GC-1 spg细胞中Lnc RNA TUG1表达显著降低。且RMVar生信预测发现在Lnc RNA TUG1中存在m6A修饰位点。RIP证实了TUG1富集在抗METTL3抗体复合物中。另外,RNA pull-down结果显示Lnc RNA TUG1mRNA 3’-UTR探针可拉取METTL3蛋白,表明METTL3与Lnc RNA TUG1的3’-UTR区结合。此外,过表达METTL3后,高糖诱导的GC-1 spg细胞中TUG1的表达显著升高,并显著降低Lnc RNA TUG1 mRNA的降解速率。另外,敲降TUG1后,过表达METTL3诱导的TUG1表达升高得到逆转。过表达METTL3后,GC-1spg活力显著升高,GC-1 spg细胞凋亡率显著降低,而敲降TUG1后,逆转了过表达METTL3对细胞活力的促进作用和对细胞凋亡的抑制作用。此外,RIP和RNA pull-down检测还表明SRSF1与TUG1形成了RNA-蛋白质复合物。敲降SRSF1后,SRSF1和Clusterin mRNA表达均下调。过表达TUG1后,Clusterin mRNA表达上调,但这种效应被SRSF1沉默所抑制。此外,RIP结果证实,过表达TUG1增强了抗SRSF1抗体处理样品中Clusterin的丰度。最后,TUG1的上调也可显著增强Clusterin mRNA的稳定性,但这种结果可被SRSF1沉默逆转。结论:1.Clusterin可通过抑制高糖诱导自噬和生精细胞凋亡来缓解糖尿病诱导的睾丸损伤。2.Clusterin可激活PI3K/Akt/m TOR信号通路减缓糖尿病诱导的睾丸损伤。3.METTL3通过m6A修饰调控Lnc RNA TUG1在高糖诱导的生精细胞损伤中发挥保护作用。4.Lnc RNA TUG1通过募集SRSF1提高Clusterin mRNA的稳定性来调控糖尿病睾丸损伤。