非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是除外酒精和其他明确的损肝因素所致的脂肪在肝脏堆积所产生的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪性变为主要病变的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝(SFL)、脂肪性肝炎(NASH)和肝硬化。该病在全球及中国呈现高发病率,中国约将近一半的肝脏疾病患者是NAFLD患者。伴随着我国肥胖、代谢综合征及糖尿病的高发病率,NAFLD的发病率逐年升高。目前临床在治疗上没有有效而证据指数高的药物,中医药在脂肪肝、高脂血症及肥胖的治疗中具有一定的优势。寻找有效安全的NAFLD中医药治疗方法并对其治疗机制进行探索具有重要意义。非酒精性脂肪肝从中医角度认为是脾虚不运,痰浊内阻为病,因此临床上主要采用健脾泄浊法进行治疗,临床上我们采用《金匮》泽泻汤加熟大黄治疗。目的：1.通过文献研究分析近10年临床治疗NAFLD的用药规律；2.通过评估不同脂肪含量的高脂纯化饲料寻找有效、重复性高的NAFLD建模饲料；3.通过低、中、高剂量的加味泽泻汤治疗NAFLD小鼠,选择最佳的治疗剂量；4.通过宏基因组学的方法探讨肠道微生物在加味泽泻汤治疗NAFLD小鼠中的潜在机制；5.通过急性毒理实验对加味泽泻汤的毒性进行评估；6.通过高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS)对水煎剂加味泽泻汤及物质基础进行分析,建立质控标准。方法：1.检索2004年至2014年中医药治疗NAFLD的临床文献,通过用药频次分析临床中治疗NAFLD的病机及用药规律；2.采用45%及60%脂肪含量高脂纯化饲料建立NAFLD小鼠,通过一般情况、血脂血糖、糖耐量实验及肝脏病理评估两种饲料的造模程度,对建模饲料进行选择；3.采用低、中、高剂量的加味泽泻汤对高脂饮食诱导的NAFLD小鼠进行干预,通过一般情况、血糖血脂、糖耐量实验及肝脏病理评估不同剂量对NAFLD小鼠的治疗效应；4.采用加味泽泻汤对NAFLD小鼠进行治疗,检测肝功能、肝脏HE及Masson染色、RT-qPCR法检测肝内炎症因子表达水平、免疫组化及western-blotting检测回肠结肠中紧密连接蛋白occludin蛋白表达、高通量测序法检测小鼠粪便16S rRNA分析粪便微生物,挖掘加味泽泻汤的潜在治疗机制；5.给予雌雄小鼠最大给药剂量的加味泽泻汤7天,观察是否死亡、体重及重要脏器病理,对加味泽泻汤进行急性毒理评估；6.通过UPLC-MS对水煎剂加味泽泻汤及物质基础进行分析,比对苍术酮、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素及2,3-乙酰泽泻醇B等对照品,并通过质谱图谱对其他物质进行鉴定分析。结果：1.文献研究中,我们对近10年来非酒精性脂肪肝的临床文献进行用药频次及规律研究,共检索出药物147种治疗药物,药物总是使用频次为960次。高频使用的药物主要为丹参7.57%、山楂7.03%、泽泻5.95%、柴胡5.73%、茯苓4.97%、白术4.11%、决明子4.11%等,按功能主要归于利水渗湿药、补虚药及活血化瘀药。从用药角度证实非酒精性脂肪肝脾运不健,痰浊内阻的病机,及运用健脾泄浊法治疗的合理性。2.对不同脂肪含量摄入的高脂饮食诱导NAFLD小鼠模型实验中,45%与60%脂肪含量高脂纯化饲料均能出现体重增加、肝脏及脂肪重量增加、血脂血糖异常、胰岛素抵抗、肝脏呈现脂肪变,显示这两种饲料均能较好的诱导出NAFLD小鼠模型,两者差异不显著,认为45%脂肪含量饲料已能满足实验需要。3.在低、中、高剂量加味泽泻汤治疗NAFLD小鼠的效应研究中,经4周治疗加味泽泻汤可显著减轻NAFLD小鼠血清AST、肝脏及病理评分,在体重、血清ALT、TC、TG、 HDL-C、LDL-C方面有一定改善趋势,但是无统计学差异。在低、中、高三个剂量组中,以低剂量与中剂量组整体治疗效果更好。整体结果显示,虽然加味泽泻汤在改善NAFLD小鼠体重、胰岛素抵抗及血脂有一定效果,但在其在改善肝内炎症反应的效应更佳,这对我们的机制探讨具有指导意义。4.对加味泽泻汤治疗NAFLD小鼠治疗的机制探讨中,主要注重于肠道微生物-肠道屏障-肝内炎症反应的研究。结果显示,(1)加味泽泻汤可减轻血清AST水平,改善肝脏组织炎症性改变,减少肝脏内胶原纤维沉积,减小脂肪细胞体积。(2)加味泽泻汤可降低由高脂模型诱导的肝脏内炎症因子的高表达,可降低IL-1β、TNFα及F4/80mRNA的表达,具有统计学意义；具有降低TLR4、NLRP3mRNA表达量的趋势；对IL-10、IL-18、Caspase-1表达无作用。(3)对肠粘膜屏障完整性具有重要意义的紧密连接蛋白occludin的表达,加味泽泻汤对回肠、结肠未改变基本结构；在回肠与结肠的免疫组化及western-blotting中,模型组occludin表达量显著下降,加味泽泻汤治疗后可回复其表达。(4)在对肠道微生物16SrRNA丰度、多样性的研究中,Ace指数模型组较空白组下降,给药组较空白组也下降；Chao指数,模型组较空白组下降,给药组较空白组下降；Shannon指数模型组较空白组下降,给药组较空白组下降；Simpson指数模型组较空白组升高,给药组较模型组指数有所下降,提示模型组及药物组较空白组肠道微生物丰度及多样性下降。(5)在门的分类学水平上,高脂饮食及加味泽泻汤的运用均能造成肠道微生物组成的较大；拟杆菌门(Bacteroidetes)在模型组较空白组升高,加味泽泻汤组较空白组Bacteroidetes升高；厚壁菌门(Firmicute)在模型组及给药组均出现了下降；变形菌门(Proteobacteria)在模型组出现升高,经加味泽泻汤干预后占比下降,此外脱铁菌门(Deferribacteres)也出现了与Proteobacteria一样的变化。(6)在属的分类学水平上,脱硫弧菌属(Desulfovibrio) OTU数量在模型组显著增长,经加味泽泻汤治疗后下降到与空白组一致的水平；普雷沃氏菌属(Prevotella)在模型组数量增加,加味泽泻汤治疗后可降低其数量；在罗氏菌属(Roseburia)及Lachnospiraceae_Incertae_Sedis属的数量表现也与Desulfovibrio、Prevotella一致。5.通过对加味泽泻汤的急性毒性实验,确定其毒理反应,以最大浓度最大容量灌胃给药,连续观察7d。结果显示,无动物死亡、无中毒反应,肝脏及肾脏病理改变。加味泽泻汤最大受试剂量是临床常规剂量的111倍,认为加味泽泻汤无明显急性毒理反应。6.通过对加味泽泻汤物质基础的研究,结果显示,(1)根据色谱峰比对苍术酮、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素及2,3-乙酰泽泻醇B的对照品及加味泽泻汤中的物质,加味泽泻汤中存在及大黄素、大黄酸、芦荟大黄素及2,3-乙酰泽泻醇B,但未找到苍术酮的色谱峰。(2)结合质谱图谱分析,加味泽泻汤中除以上物质外,还可能存在没食子酸、大黄酚、大黄素甲醚、泽泻醇A醋酸酯、泽泻醇C单乙酸酯、泽泻醇B、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ。 (3)对照品中找白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ的色谱峰,考虑苍术酮经氧化可转化为白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ。结论：结合文献研究及实验研究,加味泽泻汤药符合NAFLD病机,其主要物质基础均具有一定的降脂及改善肝脏炎症的作用,加味泽泻汤对高脂诱导的NAFLD小鼠具有良好的治疗的效果,可能通过改变NAFLD小鼠肠道微生物组成、改善肠粘膜屏障、降低肝脏内炎症因子表达及减轻肝脏炎症来发挥作用。