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研究背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤,约占女性肿瘤的四分之一。乳腺癌的发病率及病死率呈现持续上升的趋势,乳腺癌已成为严重危害着女性身体健康的头号杀手。乳腺癌与激素水平密切相关,而雌激素是乳腺癌细胞生长的主要驱动因子,约70%的乳腺癌患者呈雌激素受体(ER)阳性,因此针对ER阳性的乳腺癌内分泌治疗尤为重要。选择性雌激素受体调节因子他莫昔芬(tamoxifen)能通过竞争结合雌激素受体并抑制乳腺癌生长,已成为近30年来最主要的乳腺癌内分泌治疗药物。然而,原发性和继发性他莫昔芬耐药已成为乳腺癌内分泌治疗失败的重要原因。HGF/c-Met信号通路与肿瘤的侵袭和转移密切相关,在肿瘤的发生发展中扮演着非常重要的角色。该通路的标志特征是HGF与其配体c-Met蛋白的结合,继而引起一系列下游分子信号传导改变。那么HGF/c-Met是否参与了乳腺癌获得性他莫昔芬耐药值得研究。深入阐明HGF/c-Met信号通路参与乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的机制,有助于更全面的认识和诠释他莫昔芬耐药过程,这将为乳腺癌的防治提供新思路和新靶点。目的揭示乳腺癌细胞他莫昔芬耐药过程中的分子调控网络,阐明hgf/c-met-hotair-mir-141/200a的反馈环路生物学功能和机制,为有效监测和逆转他莫昔芬耐药提供重要的药物作用靶点。方法1.建立er阳性乳腺癌细胞mcf-7的他莫西芬耐药模型。透射电镜观测细胞微观形态;mtt、细胞克隆形成、和细胞划痕等实验检测乳腺癌耐药细胞的生物学功能。2.细胞因子芯片筛选乳腺癌亲本细胞和耐药细胞之间的差异因子;elisa分析er阳性乳腺癌初诊患者和他莫昔芬治疗后复发转移患者血清标本中hgf的表达;qpcr检测细胞hgfmrna的表达水平;蛋白水平分析c-met及其下游信号通路相关分子的活化状态。3.hgf干预以及过表达c-met基因,通过mtt、edu、细胞凋亡等实验方法分析干预处理后的功能学改变。4.生物信息学预测分析可能通过调控hgf的表达而参与乳腺癌tamoxifen耐药的microrna分子;双荧光素酶报告基因实验证实结合靶点;沉默或过表达mir-141和mir-200a的表达水平并验证功能变化;验证hotair与mir-141和mir-200a的调控关系;chip实验验证hotair与mir-141和mir-200a的结合作用方式。结果1.乳腺癌耐药细胞呈现出核分裂象增多,内质网增多等特征。乳腺癌耐药细胞具有促增殖、抗凋亡和促进细胞迁移的能力。2.乳腺癌他莫昔芬耐药细胞可以自主分泌hgf,并以自分泌的形式活化c-met及其下游信号通路;hgf水平在复发转移乳腺癌患者中明显升高;乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中hgfmrna水平的表达高于亲本细胞;c-met及其下游信号通路相关分子在乳腺癌耐药细胞中处于活化状态;重组人hgf和条件性培养基均可以增加乳腺癌细胞对他莫昔芬的耐药性;er阳性乳腺癌细胞中过表达c-met基因,可以促进乳腺癌细胞增殖和抗凋亡等生物学功能。3.c-met小分子抑制剂阻断其下游信号通路,可以显著抑制他莫昔芬耐药细胞的增殖能力。利用HGF中和性抗体处理他莫昔芬耐药细胞后,可以显著促进耐药细胞的凋亡,提高耐药细胞对他莫昔芬的治疗敏感性;4.MiR-200家族成员miR-141和miR-200a可以与HGF的3’UTR区结合从而发生负反馈调节作用;miR-141和miR-200a通过抑制HGF而参与到ER阳性乳腺癌他莫昔芬耐药过程;HOTAIR通过组蛋白甲基化等表观遗传学调控方式,抑制miR-141和miR-200a的表达;HOTAIR促进miR-141和miR-200a启动子区EZH2分子的募集和增加H3K27me3水平而发挥转录抑制的作用。结论乳腺癌他莫昔芬耐药细胞中存在着HGF/c-MET-HOTAIR-miR-141/200a的反馈环路,这一调控网络为有效监测和逆转他莫昔芬耐药提供重要的药物作用靶点。