论文部分内容阅读
七氟烷（Sevoflurane）麻醉引起Tau蛋白过度磷酸化和认知障碍是七氟烷的神经毒性重点研究的机制之一,其可能途径之一是通过增强GSK3β激酶活性及引起GSK3β和Tau之间的相互作用增强。睾酮水平影响着男性的认知能力表现,有研究指出睾酮对GSK3β的磷酸化存在调节作用,此外我们推测睾酮可能影响GSK3β和Tau之间的相互作用。相对于成年小鼠,七氟烷对幼年小鼠的Tau磷酸化和认知功能损伤更严重,因此小鼠自出生到青春期期间睾酮保护作用不足可能是导致幼年小鼠对麻醉药物损伤的敏感性更高的原因之一。本课题以GSK3β激酶活性及蛋白结合力两个机制为切入点,利用动物及细胞七氟烷麻醉模型及睾酮给药预处理,探索睾酮对多次七氟烷麻醉引起的Tau蛋白过度磷酸化、幼年小鼠认知功能改变及神经功能损伤的保护作用,并深入探究其调节GSK3β的分子机制。实验一:幼年及成年小鼠中睾酮的含量差异及多次七氟烷麻醉对Tau蛋白表达、认知功能的不同影响目的:本实验拟探讨幼年（Postnatal day 6,P6）及成年（P60）雄性C57BL/6小鼠中睾酮的含量差异及多次七氟烷麻醉（2h×3d）对幼年小鼠及成年小鼠大脑Tau蛋白表达及磷酸化、认知功能的不同影响。方法:将P6幼年雄性小鼠及P60成年雄性小鼠分别随机分为2组:对照组（Control）和麻醉组（Sevoflurane）。麻醉组连续3天给予3%七氟烷麻醉2小时,对照组在同样条件下连续3天吸入40%O22小时。各组进行对照或麻醉处理后当日（幼年P8,成年P62）取脑组织应用Western blot检测Tau-Ser202/Thr205及total Tau蛋白表达情况,应用ELISA检测各组小鼠的睾酮激素水平,应用Morris水迷宫检测小鼠认知功能情况。此外,为了记录C57BL/6小鼠自出生至成年（P60）阶段的脑组织睾酮激素水平的变化趋势,选取P0-60的多个时间点处死小鼠取脑,应用ELISA技术检测睾酮激素水平。结果:1.多次七氟烷麻醉使幼年雄性小鼠脑组织中Tau-Ser202/Thr205磷酸化明显升高,而成年雄性小鼠脑组织中Tau-Ser202/Thr205磷酸化水平无改变;2.Morris水迷宫实验中,多次七氟烷麻醉使幼年雄性小鼠出现学习记忆等认知功能损伤,而对成年小鼠无影响;3.P6雄性小鼠的大脑海马区组织睾酮含量远远低于成年雄性小鼠（P60）脑组织中的睾酮含量;4.连续3天七氟烷麻醉对小鼠的脑组织睾酮含量没有明显作用;5.随着年龄增长,小鼠脑组织睾酮变化趋势为:新生0-1天,脑组织睾酮含量较高,之后迅速降低,在P6-10天约为P60小鼠的14%,自P25-30开始明显回升,P40左右达到高峰,逐渐稳定。结论:多次七氟烷麻醉可造成幼年（P6）小鼠的Tau蛋白过度磷酸化和远期认知功能障碍,而对P60小鼠没有影响。P6小鼠大脑睾酮含量明显低于P60小鼠,且幼年期睾酮水平始终处于低值。因此,幼年小鼠易受七氟烷麻醉神经毒性损伤可能与其睾酮激素水平不足有关。实验二:睾酮对多次七氟烷麻醉引起的SH-Sy5y细胞系及原代神经元Tau蛋白磷酸化异常、细胞功能损伤的保护作用目的:本实验拟探讨七氟烷麻醉通过调节GSK3β激酶活性对SH-Sy5y细胞系及原代神经元的Tau蛋白表达及磷酸化、细胞活性及功能的损伤以及睾酮在此机制中的保护作用。方法:1.SH-Sy5y细胞:首先确定睾酮给药浓度,之后随机将SH-Sy5y细胞分为对照组（Control+Vehicle）、对照+睾酮组（Control+Testosterone）、麻醉组（Sevoflurane+Vehicle）和麻醉+睾酮组（Sevoflurane+Testosterone）4组,对照+睾酮组及麻醉+睾酮组给予100n M睾酮,预处理1小时后麻醉组及麻醉+睾酮组4%七氟烷麻醉6小时,对照组及对照+睾酮组置于培养箱中,停止麻醉后,各组应用Western blot技术检测Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262、total Tau、GSK3β-Ser 9、GSK3β-Tyr 216、total GSK3β蛋白表达水平,应用免疫荧光技术检测Tau-Ser202/Thr205蛋白表达水平,应用Live/dead细胞活性试剂盒检测细胞活性。2.原代神经元细胞:随机将神经元细胞分为对照组、对照+睾酮组、麻醉组和麻醉+睾酮组4组。对照+睾酮组及麻醉+睾酮组给予100n M睾酮,孵育1小时后对麻醉组及麻醉+睾酮组进行3%七氟烷麻醉2小时,对照组及对照+睾酮组置于培养箱,连续3天处理后各组应用Western blot技术检测Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262、total Tau、GSK3β-Ser 9、GSK3β-Tyr 216、total GSK3β、PSD-95蛋白表达水平,应用免疫荧光技术检测Tau-Ser202/Thr205蛋白表达水平,应用Live/dead细胞活性试剂盒检测细胞活性,应用全细胞膜片钳技术记录各组细胞兴奋性突触后电流（s EPSCs）的活动情况。结果:1.4%七氟烷麻醉6小时使SH-Sy5y细胞中的Tau-Ser202/Thr205表达明显增加、GSK3β-Ser9表达降低,睾酮预处理可以降低Tau-Ser202/Thr205表达、升高GSK3β-Ser9表达,Tau-Ser262、GSK3β-Tyr 216磷酸化水平未见明显改变;而连续3天3%七氟烷麻醉2小时使神经元细胞的Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262表达明显增加,使GSK3β-Ser9、PSD-95表达降低、GSK3β-Tyr 216升高,睾酮预处理可以降低Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262、GSK3β-Tyr 216表达,升高GSK3β-Ser9、PSD-95表达;2.七氟烷麻醉或睾酮预处理没有改变SH-Sy5y细胞及神经元的细胞活性;3.多次七氟烷麻醉抑制神经元s EPSCs的幅度及频率,睾酮预处理可以使神经元s EPSCs的幅度及频率有所恢复。结论:七氟烷麻醉可以导致SH-Sy5y细胞、原代神经元中的GSK3β激酶活性增加及Tau蛋白过度磷酸化,睾酮可以逆转七氟烷引起的神经毒性,抑制GSK3β激酶活性,降低Tau蛋白磷酸化水平,保护神经元突触功能,起到神经保护作用。实验三:睾酮对多次七氟烷麻醉引起的幼年小鼠Tau蛋白表达、认知功能障碍的保护作用目的:本实验拟探讨睾酮是否能够通过调节GSK3β激酶活性对多次七氟烷麻醉引起的幼年小鼠（P6）大脑Tau蛋白过磷酸化及认知功能障碍起到保护作用。方法:将幼年（P6）雄性小鼠随机分为对照组（Control+Vehicle）、对照+睾酮组（Control+Testosterone）、麻醉组（Sevoflurane+Vehicle）和麻醉+睾酮组（Sevoflurane+Testosterone）。对照+睾酮组和麻醉+睾酮组皮下注射100μg睾酮溶液,对照组及麻醉组皮下注射等量玉米油,1小时后麻醉组和麻醉+睾酮组进行3%七氟烷麻醉2小时,对照组及对照+睾酮组在同样条件下吸入40%O22小时,连续3天麻醉及给药处理结束后各组小鼠取脑组织应用Western blot技术检测Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262、total Tau、GSK3β-Ser 9、GSK3β-Tyr 216、total GSK3β蛋白表达水平;应用ELISA技术检测睾酮水平;应用HE染色技术观察大脑结构变化;应用Morris水迷宫实验测试各组小鼠海马区认知能力改变。结果:1.睾酮注射后1小时小鼠脑组织中的睾酮含量即可出现明显上升,而第3次给药后24h后小鼠脑组织中的睾酮含量基本下降至正常水平,之后睾酮含量与对照组相比均没有差异;2.麻醉或睾酮给药并没有直接造成大脑海马组织的形态学改变;3.多次七氟烷麻醉使幼鼠皮质及海马组织中Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262表达明显增加,GSK3β-Ser9表达降低,皮质中GSK3β-Tyr 216未见改变,海马中GSK3β-Tyr 216表达增加;睾酮预处理使Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262、GSK3β-Tyr 216表达降低,GSK3β-Ser9表达增加;4.Morris水迷宫实验中,睾酮预处理可以逆转多次七氟烷麻醉造成的幼鼠海马区认知功能损伤。结论:睾酮多次给药能暂时性增加小鼠脑组织中的睾酮含量,未出现长期作用,且未造成脑结构的变化。然而睾酮预处理可以抑制幼年小鼠大脑皮质、海马区中因多次七氟烷麻醉而激活的GSK3β的激酶活性,降低Tau-Ser202/Thr205、Tau-Ser262的表达,进而对多次七氟烷麻醉引起的幼年小鼠的海马区认知功能改变具有保护作用。实验四:七氟烷及睾酮对Tau蛋白与GSK3β蛋白结合力的相反作用目的:本实验拟探讨七氟烷和睾酮对GSK3β和Tau的蛋白结合力的不同作用。方法:1.SH-Sy5y细胞分组及处理方法见实验二,处理结束后后,各组应用免疫共沉淀技术检测各组Tau蛋白与GSK3β蛋白的结合情况。2.P8 C57BL/6小鼠取脑组织分离提纯Tau蛋白与GSK3β进行Nano-chip蛋白相互作用力的探测。结果:1.七氟烷麻醉使Tau蛋白和GSK3β蛋白的结合增多,而睾酮预处理减少了Tau蛋白与GSK3β蛋白的结合;2.睾酮使Tau与激活态GSK3β之间的蛋白结合力减弱。结论:七氟烷使GSK3β和Tau蛋白间的相互作用力增强进而容易引起Tau蛋白各个位点的磷酸化。而睾酮会抑制七氟烷引起的强相互作用力,使二者不易结合,进而降低Tau蛋白各个位点磷酸化的可能。