背景人脑胶质瘤约占颅内肿瘤的45%,多呈恶性表现,手术较难完全切除且复发率高。恶性胶质瘤病人生存期较短,许多病例即使手术加放化疗也仅能延长很短寿命,究其原因多是术前胶质瘤已严重侵袭脑部或术后残留肿瘤组织较快复发。目前除了手术和放化疗等传统治疗外,生物治疗、基因治疗等微观疗法越发显示出巨大潜力,尽管此类疗法多数尚处于基础或临床实验阶段。但基因治疗的最大问题在于如何有效、特异地将目的基因导入肿瘤细胞,同时又不损伤周围正常组织。近年来,已有一些研究关注如何靶向胶质瘤细胞,主要分两大类：一类是开发某种针对只存在于恶性肿瘤中基因或酶的药物,另一类是开发搭载抗癌基因的肿瘤特异性载体。对于后者,已有许多载体被开发出来,一类是病毒载体如慢病毒、腺病毒载体等,另一类是非病毒载体如脂质体、纳米粒等。病毒载体优点在于转染效率高,缺点在于免疫原性和潜在致瘤性。非病毒载体安全性高,但大多效率低。但许多技术已被用来改造非病毒载体,从而使其利用价值越来越大。聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)是一种阳离子高聚物,一定条件下可以与核酸如质粒DNA (pDNA)缩合,将其压缩成纳米级微粒即纳米粒。PEI纳米粒可被细胞吸收从而达到转染的目的。但其尚缺乏靶向性,且效率有待提高。改进非病毒载体的方法很多,连接一些功能性分子是热点之一。最常用的靶向肿瘤的因子如血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)的单克隆抗体,虽有报道其增加向胶质瘤集中的特性,但其并非真正的肿瘤靶向,其原理是胶质瘤的血供比正常组织丰富。国际上有不少新的细胞特异性配体被发现。V肽是近来发现的一种胶质瘤细胞靶向性因子,由12个氨基酸残基组成(序列为VTWTPQAWFQWV),有实验证实其能够特异地结合于胶质母细胞瘤细胞如U87细胞系,但对人星形胶质细胞等正常神经细胞几乎没有结合力。其靶向性十分明确,可使基因载体被胶质瘤吸收的同时不会干扰正常神经细胞。在本实验中,我们利用PEI、V肽和pDNA制作载基因纳米粒,用以转染恶性胶质瘤细胞尤其是胶质母细胞瘤细胞,并用大鼠正常脑组织原代培养的神经细胞做对照,探索该载体是否可成为靶向胶质瘤的转染手段。目的构建以PEI、V肽为基础的靶向于恶性胶质瘤的载基因纳米粒并验证其特性。方法1.神经细胞及肿瘤细胞培养无菌条件下,取新生1天Wistar大鼠仔大脑皮层,0.25%的胰酶37℃消化30min,加入适量血清终止消化。应用无菌巴氏管轻柔吹打使至成为细胞悬液。200目滤网过滤。细胞离心后,于Neurobasal完全培养基(2%B27添加物、1%神经生长因子(NGF)及1%青链霉素)中重悬浮及培养。培养基每2天更换1次,培养第4-5天的神经细胞用于后续实验。肿瘤细胞的培养：包括U87(人胶质母细胞瘤细胞系)、U251(人胶质瘤细胞系)、T98G(人胶质母细胞瘤细胞系)、原代胶质母细胞瘤细胞、PCI2(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系)、A549(人肺癌细胞系)及HEK293(人胚胎肾细胞系,human embryonic kidney293)。DMEM将复苏好的细胞离心后,用DMEM完全培养基(含10%FBS)重悬浮并放入的培养瓶中。当细胞融合率达到80%时,加入胰酶消化。血清终止消化后,离心,再次用DMEM完全培养基重悬浮细胞并计数。以每孔l×105的细胞数种植于24孔培养板中。待融合率达到80%时,用于后续实验。原代胶质瘤培养方法类似于原代神经细胞培养,但所用培养基为DMEM完全培养基。2.免疫细胞化学原代神经细胞培养4天后,4%多聚甲醛(PFA)室温下固定细胞15min,PBS漂洗3遍(以下每步均漂洗)。PBST透化15min。3%BSA室温下封闭1h。NSE或GFAP一抗4℃孵育过夜。荧光二抗室温下孵育1h。DAPI染核5min,最后一次漂洗。封片,荧光显微镜下观察。3.质粒扩增及提取通过感受态细菌转化、铺板、挑菌并摇菌过夜大量扩增pDNA,再利用无内毒素级质粒提取试剂盒(天根),步骤按照公司说明书进行。pDNA浓度及纯度用紫外分光光度计检测。OD260/OD280比值为1.8-2.0之间的认为合格。4.PEI活化及交联称取适量SPDP溶于DMF中制得SPDP溶液(100mM)。称取1μmol PEI溶于lml HBS缓冲液。以下反应条件均为氩气保护、室温。分别将100μl、200μl、400μl SPDP溶液逐滴加入1ml PEI溶液,涡旋振荡混匀,放置2h。然后PD-10层析柱纯化过滤,即得PEI-PDP10、PEI-PDP20、PEI-PDP40。取V肽适量溶于1ml肽段缓冲液(lOOμl DMF与900μl GnHCl缓冲液混匀而得)。按V肽/PEI-PDP的摩尔比为10：1,20：1,40：1的比例,分别将V肽溶液滴加入PEI-PDP溶液,混合均匀,反应2h。再次使用PD-10层析柱纯化过滤。即得PV10、PV20、PV40。0.22um滤膜过滤备用。用TNBS吸光度法检测PEI活化程度。吡啶-2-硫醇吸光度法检测PEI-PDP反应进度。5.纳米粒的制备及其表征检测将各组PV及pDNA溶液用HBG缓冲液稀释至一定浓度。按照预先测得的氮磷比(N/P),将DNA溶液分别逐滴加入涡旋状态下的PV溶液中,室温孵育30min即得相应纳米粒。PEI溶液作为对照。利用核磁谱仪测量合成材料的氢谱(1H NMR)。利用纳米粒度仪测量纳米粒的粒径和表面电位。利用琼脂糖凝胶电泳实验观察纳米粒压缩DNA情况。利用透射电镜观察纳米粒的形态。利用DNA抗核酸酶实验检测纳米粒对DNA的保护作用。详细方法见正文。6.体外转染实验将U87细胞系以1×105个/孔接种于24孔板。待细胞聚合度达80%时,将新制作的PV-DNA纳米粒加入到无血清培养基并与细胞孵育,37℃,5h。之后用DMEM (10%FBS)换液,24h后在荧光显微镜下观察EGFP表达细胞数量和比例,并用流式细胞仪对其转染效率精确分析。T98G、U251及原代胶质瘤细胞转染步骤相同。另外PC12、A549、HEK293及原代神经细胞作为细胞对照。裸DNA作为阴性对照,Lipofectamine作为阳性对照。需考察的因素有：DNA用量、N/P比值、转染时间、转染介质、血清的影响、PV种类。7.转染机理实验通过吸附实验、内化实验及竞争性抑制实验验证纳米粒特异地被胶质瘤细胞吸收是由于V肽的作用。(1)吸附实验：接种U87、PC12细胞系及原代神经细胞于玻片上37℃过夜,3%BSA溶液37℃封闭1h,0.02mg/ml的FITC-V肽溶液(于1%BSA中)孵育37℃30min,固定封片,荧光显微镜下观察。(2)内化实验：先将pDNA用荧光试剂盒标记,利用PV及PEI制作DNA纳米粒,进行如上所述的转染实验,3h后镜下观察。(3)竞争性抑制实验：转染方法同上,不同的是在加入纳米粒前,先加入1000倍浓度于纳米粒中V肽的游离V肽溶液,37℃孵育1h后,再加入纳米粒孵育。8.细胞活性实验采用CCK-8试剂盒测定细胞活性。使用96孔培养板,纳米粒制作及转染流程同上述方法。检测方法遵厂商说明书。9.统计分析所得数据用Means±SEM表示。统计方法详见正文。P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.细胞培养光镜下,4-5天后神经细胞生长已较丰满,神经元突起清晰,胞体饱满,成网络状。胶质细胞呈梭形或多角形,扁平。各胶质瘤细胞系在呈现梭形或不规则形的基础上形态有所差异。免疫荧光检测显示神经元被NSE抗体标记为绿色,胶质细胞被GFAP抗体标记红色。2.PEI活化及交联由TNBS方法测得PV的产率为80.1±1.53%,其标准曲线方程为y=0.0697x+0.0071(R2=0.9998),其中y为吸光度,x为样品摩尔浓度(μmol/ml)。PEI-PDP利用率由吡啶-2-硫醇方法测得为86.2+5.17%,即SPDP利用率。根据SPDP活化程度不同,分别得PV10、PV20、 PV40三种材料。3.纳米粒表征核磁共振氢谱(1H-NMR)证实PEI确实与V肽连接成功。粒径测量确认了滴加速度为10s、涡旋速度为中档时,PEI纳米粒粒径已较稳定,为69.8±4.15nm。凝胶电泳确认PEI、PV10、PV20、PV40完全压缩DNA的比例分别为2、3、5、6。另外,PV10、PV20、PV40纳米粒较PEI纳米粒粒径变大、表面电位变小。透射电镜观察证实各组纳米粒均为球状,但直径不同。抗核酸酶实验发现各组纳米粒均有较强的保护DNA的能力。4.转染实验首先利用HEK293细胞摸索了PEI纳米粒基础转染条件：当N/P=10/1,DNA浓度为0.1mg/ml,转染时间为5h,转染介质为无血清DMEM时,转染效率可最大化。其次,利用PV10、PV20、PV40纳米粒分别转染U87细胞,发现三种纳米粒均较PEI纳米粒提高了U87细胞转染效率,其中PV20效果最佳。另外,转染介质中混入血清对Lipofectamine、PEI及PV纳米粒均有影响,但对PV纳米粒影响非常小,对Lipofectamine影响较大。不同胶质瘤细胞系转染效率虽均有提高但也有不同：以PV20纳米粒为例,U87细胞的效率提升最为明显；U251及T98G细胞系次之；原代胶质母细胞瘤转染效率亦提升较明显但差异稍大。PV20纳米粒对PC12、A549细胞系转染效率无提升,而对神经细胞转染效率为零,纳米粒靶向性良好。5.细胞活性PV10、PV20、PV40纳米粒对细胞的毒性均比PEI纳米粒小(P<0.05),且V肽所占比例越高细胞活性也越高。PV20纳米粒对神经细胞毒性很小,远低于PEI纳米粒(P<0.01)及Lipofectamine (P<0.05)。6.转染机理吸附实验、竞争性抑制实验及内化实验。吸附实验显示,FITC-V可很好地吸附于U87细胞但不能吸附于PC12及原代神经细胞,说明其特异性。内化实验显示,Lyso-tracker Red标记的溶酶体与FITC-label IT标记的DNA没有在细胞内共定位,说明PV20纳米粒成功逃逸溶酶体。竞争性抑制实验显示,游离V肽与U87细胞预孵育后,PV20纳米粒对U87的转染效率显著下降(P<0.001),说明该纳米粒促进转染的动力的确来自于V肽的靶向能力。结论V肽能特异吸附于U87胶质母细胞瘤细胞表面而不被其他非胶质瘤细胞系或神经细胞吸附。经过V肽改造的PV纳米粒能够靶向地输送目的基因进入多种胶质瘤细胞尤其是胶质母细胞瘤细胞,而不伤害神经细胞。制作工艺的优化和转染实验的筛选发现PV20纳米粒效果最佳。背景人脑胶质瘤约占颅内肿瘤的半数,大部分脑胶质瘤呈恶性表现,手术一般难以彻底切除,复发率相当高。恶性胶质瘤如胶质母细胞瘤的病人生存期较短,目前联合疗法(手术加放化疗)也很难显著延长生存期。故而学者们开始在传统疗法外寻找新方法,如生物治疗、基因治疗等。但新兴的微观疗法目前多处于基础或临床实验阶段。目前基因治疗尚有许多问题亟待解决,如探索肿瘤基因谱、寻找肿瘤杀伤基因、寻找安全有效的载体等。基因载体主要分为两大类,病毒载体和非病毒载体。前者转染细胞效率高,但存在免疫原性或潜在致瘤性的问题。后者安全性高、造价低,但转染效率无法和病毒媲美。于是人们想到,若能结合两者的优点并减少弱点,将是基因载体方面的前进方向。因此各种改造非病毒载体而使其模拟病毒的策略被学者们提出。纳米粒是非病毒载体中的一大类,其中又以阳离子高聚物为基础合成的纳米粒应用甚为广泛。聚乙烯亚胺(Polyethylenimine, PEI)、多聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL),多聚精氨酸(Poly-Arginine),壳聚糖(Chitosan)等都属于阳离子高聚物,一定条件下可以与核酸如质粒DNA (pDNA)聚合,将其压缩成纳米粒。PEI是最常用的一种,也是本实验第一部分所用的基本材料。第一部分中以PEI为基础的纳米粒,的确大大增加了转染胶质瘤细胞的效率,而且其细胞毒性很低。PLL亦是一种高分子材料,其可生物降解的特性可使其生物相容性更高。然而,由PLL做出的纳米粒往往转染效率也较低,究其原因是这类材料阳离子成分含量低,较难与带负电的细胞膜结合并入胞,即使进入细胞后也较难逃脱被溶酶体破坏的命运。Melittin是近来发现的一种肽段(简称M肽)。M肽在pH中性环境下对细胞生物膜有较弱的穿透性,而在酸性环境下该特性大大增强。这种放佛“智能”的特性引起了学者们的关注。国际上已有报道某些效率低的基因载体被该多肽改造后,具备了像PEI那样的溶酶体逃逸功能,甚至比PEI高出许多倍,同时对细胞活性影响不大。V肽在本课题第一部分中已经论述,是一种胶质瘤细胞靶向性因子。本课题第二部分,使用两种多肽改造PLL纳米粒,增强该纳米粒的靶向性和溶酶体逃逸能力,使一个低效的PLL非病毒载体的性能得到提升,成为高效、靶向又更安全的胶质瘤转基因载体。目的构建以PLL、V肽及M肽为基础的恶性胶质瘤的靶向载基因纳米粒并验证其特性。方法1.神经细胞及肿瘤细胞培养神经细胞及各肿瘤细胞的培养方法同第一部分。2.质粒扩增及提取质粒扩增及提取方法同第一部分。3.PLL活化及交联称取适量SPDP溶于DMF中制得SPDP溶液(100mM)。称取1μmol PLL溶于1ml HBS缓冲液。以下反应条件均为氩气保护、室温。将100,200及400μl SPDP溶液逐滴加入1ml PLL溶液,涡旋振荡混匀,室温放置2h。然后用PD-10层析柱纯化过滤,得PLL-PDP20。取V肽及M肽适量分别溶于1ml肽段缓冲液(100μl DMF与900μl GnHCl缓冲液混匀而得)。按多肽/PLL-PDP的摩尔比为5：1,10：1及20：1的比例,分别将V肽及M肽溶液滴加入PLL-PDP溶液,混合均匀,室温反应2h。再次使用PD-10层析柱纯化过滤,即得PLL-V5,PLL-V10及PLL-V20; PLL-M5, PLL-M10及PLL-M20。0.22um滤膜过滤备用。用TNBS吸光度法检测PLL活化程度。吡啶-2-硫醇吸光度法检测PLL-PDP反应进度。4.纳米粒的制备及其表征检测将不同的PLL-V及PLL-M等比例交叉混合,得9组三元高聚物,统称为PLL-VM,亚组分别为PLL-V5M5、PLL-V5M10、PLL-V5M20、PLL-V10M5、 PLL-V10M10、PLL-V10M20、 PLL-V20M5、PLL-V20M10、PLL-V20M20;加之上述的6组二元高聚物PLL-V5、PLL-V10、PLL-V20、PLL-M5、PLL-M10及PLL-M20共15组。各组混合高聚物及pDNA溶液分别用HBG缓冲液稀释至一定浓度。按照预先测得的氮磷比(N/P),将DNA溶液分别逐滴加入涡旋状态下的PLL-VM溶液中,室温孵育30min即得相应的PLL-VM、PLL-V及PLL-M纳米粒。PLL纳米粒作为对照。利用核磁谱仪测量合成材料的氢谱(1H NMR)。利用纳米粒度仪测量纳米粒的粒径和表面电位。利用琼脂糖凝胶电泳实验观察纳米粒压缩DNA情况。对于PLL-V20M20、PLL-V20、PLL-M20纳米粒再行DNA抗核酸酶实验、透射电镜观察。5.体外转染实验纳米粒制作基础条件控制：N/P=10/1, DNA浓度为0.1mg/ml,转染时间为5h,转染介质为无血清DMEM。将U87细胞系以1×105个/孔接种于24孔板。待细胞聚合度达80%时,将新制作的各组PLL-VM纳米粒分别加入到无血清培养基并与细胞孵育,37℃,5h。之后用DMEM (10%FBS)换液,24h后在荧光显微镜下观察EGFP表达细胞数量和比例,并用流式细胞仪对其转染效率精确分析。T98G、U251原代胶质瘤细胞转染步骤相同。另外HEK293及原代神经细胞作为细胞对照。裸DNA作为阴性对照,Lipofectamine作为阳性对照。6.转染机理实验通过竞争性抑制实验验证纳米粒特异地被胶质瘤细胞吸收是由于V肽的作用,方法同第一部分。而M肽未行竞争性抑制实验检测,因为高浓度的M肽本身对细胞有破坏作用。7.细胞活性实验采用CCK-8试剂盒测定细胞活性。方法同第一部分。8.统计分析统计方法同第一部分。结果1.PLL活化及交联由TNBS方法测得PLL-V及PLL-M的产率分别为78.3+1.69%和79.2±2.37%。PLL-PDP利用率由毗啶-2-硫醇方法测得为89.3+2.27%。2.纳米粒表征核磁共振氢谱(1H-NMR)证实PLL确实与V肽或连接成功。凝胶电泳确认PLL-V5及-M5、PLL-V10及-M10、PLL-V20及-M20完全压缩DNA的比例分别为4/1、6/1、8/1。PLL纳米粒最佳压缩比为3/1。修饰多肽的纳米粒比未修饰纳米粒粒径变大、表面电位变小。透射电镜观察证实各组纳米粒均为球状。抗核酸酶实验发现各组纳米粒均有较强的保护DNA的能力。3.转染实验将15个亚组的纳米粒依次进行U87细胞转染实验,发现除PLL-V5外,所有亚组效率较PLL组均提高,但以PLL-V20M20纳米粒转染效率最高,与Lipofectamine组无显著差异。转染介质中混入血清可显著降低Lipofectamine的效率,但对PLL-V20M20纳米粒影响较小。另外,PLL-V20M20纳米粒对其他几种胶质瘤细胞的效率提升也非常显著。所有纳米粒对对照细胞及神经细胞转染效率均无提升。4.细胞活性转染效果最好的PLL-V20M20纳米粒对细胞的毒性均小于PLL纳米粒(P<0.01)及Lipofectamine (P<0.05);对神经细胞活性影响也很小,远低于PLL纳米粒(P<0.01)。5.转染机理竞争性抑制实验显示,PLL-V20M20纳米粒对胶质瘤细胞的转染效率显著提升的动力是来源于V肽的靶向能力合并M肽的溶酶体逃逸能力。结论PLL-V纳米粒不能较好地促进胶质瘤细胞转染。PLL-VM复合纳米粒由以PLL-V20M20纳米粒能较好地促进胶质瘤细胞转染,同时对神经毒性最小。