心肌梗塞（Myocardial infarction,MI）是全世界死亡和致残的主要原因之一。我国的形式也相当严峻,MI患者的死亡率和致残率正在逐年增加。目前,治疗MI最有效的治疗方式是静脉药物溶栓治疗或经皮冠状动脉介入治疗,尽早的恢复缺血心肌细胞的血液供应,能有效挽救缺血损伤的心肌,减少心肌梗死的面积,改善患者临床结局。然而,急性MI治疗窗时间短暂,一旦错过心梗的黄金治疗时间,患者的疗效显著下降,甚至引起残疾和死亡。因此,寻找MI的靶向治疗药物及阐明其可能机制具有重要意义。淫羊藿次苷Ⅱ（icariside Ⅱ,ICS Ⅱ）又叫宝藿苷Ⅰ,是从淫羊藿中衍生出来的活性黄酮类化合物,具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗骨质疏松及抗癌等多种生物和药理作用。既往研究证实淫羊藿及其活性成分可通过调节SIRT1与Nrf2蛋白表达对抗心肌细胞损伤;还可通过激活PI3K/Akt/eNOS通路以及下调p-p38和p-JNK蛋白水平来降低心肌细胞凋亡。淫羊藿素可使NF-κB通路失活,抑制炎症因子分泌和释放,缓解大鼠心肌缺血再灌注（Ischemia reperfusion,IR）的心肌损伤。进一步研究发现ICS Ⅱ也具有多种心脏保护作用,例如减轻心肌纤维化和改善糖尿病性心肌病。然而,ICS Ⅱ在缺血缺氧诱导的心肌细胞中的具体作用和相关的分子机制仍然不清楚。微小核糖核酸（MiRNA/miRs）是一组内源性非编码单链小RNA,与细胞生长、发育、分化以及细胞凋亡等多种生物进程密切相关。近年来,研究者发现多种药物可通过调节miRNA转录和表达发挥药理活性,包括ICS Ⅱ。microRNA-7-5p（miR-7-5p）为miRNAs家族中新发现的miRNA,在多种癌症的发生和发展中发挥重要作用,如食管癌、胃癌、鼻咽癌、肺癌等。此外,既往报道指出,miR-7-5可降低IR诱导的心肌细胞损伤。但是,miR-7-5p是否在缺血缺氧诱导心肌细胞损伤中发挥作用尚未见报道。PI3K/Akt信号通路参与多种细胞生物过程,是机体最重要的信号通路之一。研究证实,PI3K/Akt信号通路在缺血和缺氧损伤的心脏保护中起着关键作用。既往研究者亦证实ICS Ⅱ可以调节PI3K/Akt通路发挥作用。然后,ICS Ⅱ能否调节PI3K/Akt信号对缺氧损伤的心肌细胞发挥保护作用尚不明确。于是,我们提出如下假说:ICS Ⅱ通过调节miR-7-5p表达和激活PI3K/Akt信号通路减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。为了验证我们的假说,我们将体外构建H9C2心肌细胞缺氧损伤模型,通过CCK8检测细胞的活性,乳酸脱氢酶（LDH）释放实验检测的细胞毒性,流式细胞术和Western blot检测凋亡水平,心肌细胞迁移和侵袭能力的检测,miRNA微阵列分析、生物信息学分析、双荧光素酶报告基因检测,阐明ICS Ⅱ是否在缺氧诱导心肌细胞损伤中发挥作用及可能的机制。第一部分 淫羊藿次苷Ⅱ减轻缺氧诱导心肌细胞损伤目的:探讨ICS Ⅱ是否能减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。方法:1)H9C2心肌细胞分别缺氧4h、8h、12h和24h,CCK8检测心肌细胞的活性,确定最佳缺氧时间。随后使用LDH释放实验,检测细胞的毒性,流式细胞术检测细胞的凋亡水平,Western blot检测凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-9/Procaspase-9、Cleaved caspase-3/Procaspase-3、Bax和Bc12 的表达,心肌细胞迁移和侵袭能力的检测,确定缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤模型构建成功。2)分别用2μM、4μM和8μM ICS Ⅱ预处理H9C2心肌细胞24h,CCK8检测心肌细胞的活性,确定ICS Ⅱ最佳干预的浓度。实验分组:正常对照组（Ctrl）,心肌细胞缺氧损伤组（Hypoxia）,心肌细胞缺氧损伤+ICS Ⅱ干预组（Hypoxia+ICSⅡ）。检测方法同时,明确ICS Ⅱ能否减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。结果:1)与正常对照组相比,H9C2心肌细胞缺氧8、12和24h后细胞活性明显下降,其中缺氧24h细胞活性最低（*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001）,最终我们以缺氧24h作为缺氧损伤模型。与正常对照组相比,H9C2心肌细胞缺氧损伤后细胞凋亡水平明显增加（***P＜0.001）,细胞毒性明显增加（***P＜0.001）。与正常对照组相比,H9C2 心肌细胞凋亡的水平和 Cleaved caspase-9/Procaspase-9、Cleavedcaspase-3/Procaspase-3 的比值及促凋亡蛋白 Bax的表达均增加（***P＜0.001,***P＜0.001,***P＜0.001,***P＜0.001）,抑凋亡蛋白Bcl-2的表达下降（***P＜0.001）。缺氧24h后H9C2心肌细胞迁移和侵袭能力均明显降低（***P＜0.001,***P＜0.001）。2)不同浓度ICS Ⅱ干预心肌细胞无明显差异（P＞0.05）。因此,我们选择8 μM ICS Ⅱ用于后续实验。与Hypoxia组相比,Hypoxia+ICS Ⅱ组细胞活性明显增加（**P＜0.01）,细胞毒性明显降低（**P＜0.01）。与Hypoxia组相比,Hypoxia+ICS Ⅱ 组细胞凋亡水平（（**P＜0.01））和 Cleaved caspase-9/Procaspase-9比值、Cleaved caspase-3/Procaspase-3比值及促凋亡蛋白Bax表达均下降（**P＜0.01,***P＜0.001,**P＜0.01）,抑凋亡蛋白 Bcl-2 表达增加（**P＜0.01）。与Hypoxia组相比,Hypoxia+ICS Ⅱ组心肌细胞迁移和侵袭能力明显增加（***P＜0.001,**P＜0.01）。结论:1)成功建立缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤模型。2)ICS Ⅱ减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。第二部分 ICS Ⅱ通过调节miR-7-5p/BTG2轴减轻缺氧诱导心肌细胞损伤目的:1)阐明ICS Ⅱ是否通过上调miR-7-5p减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。2)探讨miR-7-5p是否通过负向调控BTG2表达降低缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。3)明确BTG2在缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤中的作用。方法:1)ICS Ⅱ预处理H9C2心肌细胞后,MiRNA microarray analysis实验筛选下游表达变化的MiRNAs。随后,分别用2μM和8μM ICS Ⅱ预处理H9C2心肌细胞,RT-PCR检测miR-7-5p表达验证ICS Ⅱ能否调节miR-7-5p表达。实验分组:常氧+miR-7-5p NC 组、Hypoxia+miR-7-5p NC mimics 组、Hypoxia+ICSⅡ+miR-7-5p NC 组、Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p mimics 组,Hypoxia+ICSⅡ+miR-7-5p inhibitors组。随后用CCK8检测心肌细胞的活性,LDH释放实验检测细胞的毒性,流式细胞术检测细胞的凋亡水平,Western blot检测凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-9/Procaspase-9、Cleaved caspase-3/Procaspase-3、Bax和Bc12的表达,心肌细胞迁移和侵袭能力的检测,明确ICS Ⅱ能否通过调节miR-7-5p减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。2)使用TargetScan bioinformatics软件预测miR-7-5p下游靶点基因,荧光素酶报告基因检测验证结合位点。分别转染miR-7-5p mimics和miR-7-5p inhibitors,RT-PCR和Western bolt检测BTG2表达。构建BTG2过表达质粒（pcDNA3.1 BTG2）,Western bolt 验证 pcDNA3.1 BTG2 转入 H9C2 细胞后 BTG2 是否过表达成功。实验分组:正常对照组,Hypoxia组,Hypoxia+miR-7-5p mimics组,Hypoxia+pcDNA3.1+miR-7-5p mimics 组,Hypoxia+pcDNA3.1 BTG2+miR-7-5p mimics组。检测方法同时,明确miR-7-5p是否通过靶向调节BTG2表达减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。3)构建两种 BTG2 干扰序列（siBTG2#1 和 siBTG2#2）,Western blot 检测BTG2在H9C2细胞中表达,明确siBTG2沉默载体是否构建成功。实验分组:正常对照组,Hypoxia+si Ctrl组,Hypoxia+si BTG2#1组,Hypoxia+si BTG2#2组。检测方法同时,明确BTG2在缺氧诱导H9C2细胞损伤中的作用。结果:1)miRN芯片结果显示,ICS Ⅱ预处理H9C2心肌细胞后,有11个miRNAs表达上调,11个miRNAs表达下调,其中miR-7-5p上调最明显。分别用2μM和8 μM ICS Ⅱ预处理H9C2心肌细胞后,RT-PCR检测miR-7-5p表达,发现ICSⅡ 干预后 miR-7-5p 表达均明显增加（**P＜0.01,***P＜0.001）。转染 miR-7-5p mimics 和 miR-7-5p inhibitors 后,RT-PCR 检测 miR-7-5p 表达,发现转染 miR-7-5p mimics 后 miR-7-5p 表达明显上调（***P＜0.001）,转染 miR-7-5p inhibitors 后miR-7-5p表达明显下调（**P＜0.01）。CCK8和LDH检测发现,相比于Hypoxia+miR-7-5p NC mimics 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p NC 组细胞活性明显增加（**P＜0.01）,细胞毒性降低（***P＜0.001）;相比 Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p NC 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p mimics 组细胞活性明显增加（***P＜0.001）,细胞毒性降低（*P＜0.05）,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p inhibitors 组细胞活性明显降低（**P＜0.01）,细胞毒性明显增加（***P＜0.001）。相比于 Hypoxia+miR-7-5p-NC mimics 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p NC 组细胞凋亡水平（***P＜0.001）、凋亡蛋 白 Cleaved caspase-9/Procaspase-9 比值（***P＜0.001）、Cleaved caspase-3/Procaspase-3比值（***P＜0.001）及促凋亡蛋白Bax表达均下调（**P＜0.01）,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达上调（***P＜0.001）。相比Hypoxia+ICSⅡ+miR-7-5p NC 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p mimics 组细胞凋亡水平（*P＜0.05）下降;相比 Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p NC 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p inhibitors组细胞凋亡水平（**P＜0.01）、凋亡蛋白 Cleaved caspase-9/Procaspase-9 比值（***P＜0.001）、Cleaved caspase-3/Procaspase-3 比值（***P＜0.001）、及促凋亡蛋白Bax表达均下降（**P＜0.01）均明显增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表达下降（***P＜0.001）。2)TargetScan bioinformatics软件预测发现BTG2是miR-7-5p的潜在靶点。荧光素酶报告基因分析检测发现miR-7-5p和BTG2之间有结合位点,BTG2-wt的荧光素酶活性明显被miR-7-5p抑制（***P＜0.001）,而BTG2-mut无明显变化。RT-PCR和Western Bolt检测BTG2表达发现,过表达miR-7-5p后,BTG2的表达明显下调（***P＜0.001,***P＜0.001）,抑制miR-7-5p后,BTG2的表达明显上调（***P＜0.001,***P＜0.001）。Western bolt 检测发现转染 pcDNA3.1 BTG2后,H9C2细胞BTG2过表达（***P＜0.001）。细胞迁移和侵袭实验检测发现,相比于Hypoxia组,Hypoxia+miR-7-5p mimics组心肌细胞迁移和侵袭能力增强（***P＜0.001,***P＜0.001）;相比于 Hypoxia+pcDNA3.1+miR-7-5p mimics组,Hypoxia+pcDNA3.1 BTG2+miR-7-5p mimics组细胞迁移和侵袭能力明显降低（***P＜0.001,***P＜0.001）。CCK8 和 LDH 检测发现,相比于 Hypoxia 组,Hypoxia+miR-7-5p mimics组心肌细胞细胞活性明显增加（***P＜0.001）,细胞毒性降低（***P＜0.001）;相比 Hypoxia+pcDNA3.1+miR-7-5p mimics 组,Hypoxia+pcDNA3.1 BTG2+miR-7-5p mimics 组细胞活性明显降低（***P＜0.001）,细胞毒性增加（**P＜0.01）。相比于 Hypoxia 组,Hypoxia+miR-7-5p mimics 组细胞凋亡水平（***P＜0.001）和凋亡蛋白表达降低（***P＜0.001,***P＜0.001,**P＜0.01）,抑凋亡蛋白增加（***P＜0.001）;相比 Hypoxia+pcDNA3.1+miR-7-5p mimics 组,Hypoxia+pcDNA3.1 BTG2+miR-7-5p mimics 组凋亡增加（***P＜0.001,***P＜0.001,***P＜0.001,**P＜0.01,***P＜0.001）。3)Western blot 检测发现,siBTG2#1 和 siBTG2#2 转染 H9C2 细胞 24h 后,BTG2表达较正常对照组明显下调（***P＜0.001,***P＜0.001）。相比Hypoxia+si Ctrl,Hypoxia+si BTG2#1 组和 Hypoxia+si BTG2#2 组细胞活性明显增加（***P＜0.001,***P＜0.001）,细胞毒性降低（***P＜0.001,***P＜0.001）。流式细胞术和Western blot检测心肌细胞凋亡发现,相比Hypoxia+si Ctrl,Hypoxia+si BTG2#1 组和 Hypoxia+si BTG2#2 组细胞凋亡明显下降（***P＜0.001,***P＜0.001）。相比 Hypoxia+si Ctrl,Hypoxia+si BTG2#1 组和 Hypoxia+si BTG2#2组细胞迁移和侵袭能力明显增加（***P＜0.001,***P＜0.001）。结论:1)ICS Ⅱ通过上调miR-7-5p减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。2)miR-7-5p通过负向调控BTG2表达降低缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。3)沉默BTG2减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤。第三部分 ICS Ⅱ通过调节miR-7-5p激活PI3K/Akt通路减轻缺氧诱导心肌细胞损伤目的:1)明确ICS Ⅱ是否调节miR-7-5p激活PI3K/Akt通路。2)阐明ICS Ⅱ是否激活PI3K/Akt通路减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。方法:1)实验分组:正常对照组,Hypoxia 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p-NC mimics组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p mimics 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p-NC inhibitors组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p inhibitors 组。Western blot 检测 p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt表达。2)实验分组:正常对照组,Hypoxia 组,Hypoxia+ICS Ⅱ 组,Hypoxia+ICS Ⅱ组+LY294002 组。Western blot 检测 p-PI3K、PI3K、p-Akt 和 Akt 表达。CCK8检测心肌细胞活性,LDH释放实验检测细胞的毒性,流式细胞术检测细胞的凋亡水平,Western blot 检测凋亡相关蛋白 Cleaved caspase-9/Procaspase-9、Cleaved caspase-3/Procaspase-3、Bax和Bc12的表达,心肌细胞迁移和侵袭能力的检测,明确ICS Ⅱ是否通过活化PI3K/Akt信号通路减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。结果:1)相比于 Hypoxia 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p-NC mimics 组 p-PI3K/PI3K和 p-Akt/Akt 比值明显增加（**P＜0.01,***P＜0.001）,相比于 Hypoxia+ICSⅡ+miR-7-5p mimics 组,Hypoxia+ICS Ⅱ+miR-7-5p inhibitors 组中 p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt比值明显降低（***＜0.001,**P＜0.01）。2)相比于 Hypoxia 组,Hypoxia+ICS Ⅱ 组 p-PI3K/PI3K 和 p-Akt/Akt 比值明显增加（***P＜0.001,***P＜0.001）,相比于 Hypoxia+ICS Ⅱ 组,Hypoxia+ICS Ⅱ组+LY294002 组 p-PI3K/PI3K 和 p-Akt/Akt 比值下降（**P＜0.01,***P＜0.001）。相比于Hypoxia+ICS Ⅱ组,Hypoxia+ICS Ⅱ组+LY294002组心肌细胞细胞活性明显降低,细胞毒性明显增加（**P＜0.01,**P＜0.01）。流式细胞术和Western blot实验发现,相比于Hypoxia+ICS Ⅱ组,Hypoxia+ICS Ⅱ组+LY294002组心肌细胞凋亡明显增加（**P＜0.01,***P＜0.001）。相比于 Hypoxia+ICS Ⅱ 组,Hypoxia+ICSⅡ组+LY294002组细胞迁移和侵袭能力明显降低（**P＜0.01,*P＜0.05）。结论:1)ICS Ⅱ 调节 miR-7-5p 激活 PI3K/Akt 通路。2)ICS Ⅱ激活PI3K/Akt通路减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。总结本研究中,我们证实ICS Ⅱ通过降低细胞毒性和凋亡,增强细胞活性、迁移和增殖能力减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。进一步探讨ICS Ⅱ作用机制,发现ICSⅡ可通过调节miR-7-5p表达减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。miR-7-5p可负向调控BTG2表达,沉默BTG2可减轻缺氧诱导H9C2心肌细胞损伤,说明ICS Ⅱ通过调控miR-7-5p/BTG2轴对缺氧诱导心肌细胞损伤发挥保护作用。此外,ICS Ⅱ通过调节miR-7-5p激活PI3K/Akt信号通路减轻缺氧诱导心肌细胞损伤。总之,我们在本研究中阐明了 ICS Ⅱ在缺氧诱导心肌细胞损伤中的作用,并探讨了其分子机制,这将为MI的防治提供新思路和新的治疗靶点。