嗜菌异小杆线虫对蛴螬致病的生理生化机制研究

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地下害虫是农业虫害中重要的一类,蛴螬作为各类地下害虫中的的优势种群,每年给农业生产带来严重的经济损失。昆虫病原线虫(Entomopathogenicnematodes,简称“EPN或病原线虫”)是近年来研究最多的生物农药之一,也是防治地下害虫的理想药剂之一。虽然国内外有关利用昆虫病原线虫防治蛴螬的报道很多,但其对蛴螬的致病机理方面的研究并不系统。基于此,为进一步明确病原线虫对蛴螬的杀虫内在机理,为昆虫病原线虫的应用提供指导,开展了以下几方面的研究,主要结果如下:1.测定了蛴螬感染嗜菌异小杆线虫沧州品系(Heterorhabditis bacteriophoraCangzhou strain)后其酚氧化酶(PO)、羧酸酯酶(CarE)活性的变化。结果表明,线虫侵染后蛴螬PO和CarE活性表现出“升高-峰值-下降”的变化过程。华北大黑鳃金龟(Hololtrichia oblita Faldermann)、暗黑鳃金龟(Holotrichia parallelaMotschulsky)和铜绿丽金龟(Anomala corpulenta Motschulsky)三种金龟子2龄幼虫PO活性分别在24h、12h、36h达到最大值并显著高于对照(P<0.05),CarE活性则分别在48h、36h、48h达到最大值且显著高于对照(P<0.05)。2.利用透射电镜技术,观察华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟2龄幼虫感染嗜菌异小杆线虫沧州品系后,脂肪体细胞以及中肠细胞的形态变化。结果表明:注射200Ijs(感染期病原线虫悬浮液)24h、48h后脂肪体和中肠的组织结构按时序逐渐发生变化,开始脂肪球变形或变小,颜色变浅,脂肪体细胞和中肠细胞内质网、线粒体肿胀,中肠微绒毛变形脱落等,到48h包裹脂肪球的膜结构破裂,脂肪体细胞和中肠细胞线粒体破裂,内质网数量减少,中肠微绒毛大量脱落,同时核内染色质大量解离,核膜破裂。3.确立了蛴螬蛋白质样品制备的方法。通过比较三氯乙酸/丙酮沉淀法、饱和酚法和直接裂解法3种蛋白的提取方法,综合考虑蛋白提取率,蛋白SDS-PAGE条带分析以及双向电泳图谱分析,最终确定饱和酚法是制备蛴螬全蛋白的最佳方法。其产率为14.18mg/g,SDS-PAGE中得到26个条带,双向电泳分析中蛋白点数目达到745个,条带数目以及蛋白点数目均为3种方法中最多。同时,该方法得到的双向电泳凝胶图谱上蛋白点分布均匀,重复性好。以上研究为在昆虫病原线虫侵染条件下蛴螬的差异蛋白组分析奠定了基础。4.利用双向电泳技术对昆虫病原线虫侵染导致的蛴螬差异蛋白表达进行了分析,每头蛴螬注射200Ijs(感染期昆虫病原线虫)后其蛋白表达发生了显著变化,注射后病原线虫24h,通过得到的2-DE图谱进行分析,与对照相比,有9个蛋白点表达上调,13个下调。利用MALDI-TOF/TOF MS质谱对差异蛋白进行了鉴定,有8个蛋白得到了准确的鉴定,这些蛋白包括血淋巴蛋白、免疫相关蛋白、能源代谢相关酶、肌动蛋白、寄生物相关蛋白等。
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