本文对刺参(Apostichopus japonicas)体内无机硒及有机硒的分离提取工艺进行了优化,建立了无机硒和有机硒的分离方法,进而进行了不同地区刺参群体不同组织内硒形态的初步分析,并研究了不同浓度的外源硒对刺参的生物学影响,为研发一种新型绿色水产动物免疫增强剂以及获得天然安全的富含有机硒的刺参提供理论依据。主要研究内容包括:一、无机硒和有机硒的分离方法的建立与优化硒具有提高人体免疫力,对有害物质的解毒及抗衰老作用,是人体所需要的重要微量营养元素之一。硒特殊的生理、生化功能不仅取决于其总浓度水平,而且同硒存在的化学形态以及不同化学形态下硒化物的浓度水平密切相关,无机硒的毒性远远大于有机硒,因此采用准确有效的测定总硒及无机硒含量的方法非常重要。本文通过比较和实验,采用HCl水浴提取法、Tris-HCl-甘油提取法、透析袋透析法及超纯水超声破碎法四种方法进行有机硒和无机硒分离,确定了超纯水超声破碎法浸提无机硒的效果最好。首次通过改变超声破碎的时间、设置不同的水浴时间及水浴温度、改变环己烷萃取次数的技术参数,确立了从刺参样品中提取硒的最优条件,建立和优化了无机硒与有机硒的分离方法,并对测定分析方法进行了方法检出限计算及回收率、精密度实验,在优化的工作条件下,硒浓度为0~30μg/L,与荧光强度有良好的线性关系,线性方程为I=133.06*C+21.76,相关系数r=0.9998,最低检出限为0.0005 ng/m L;样品总硒的回收率达到95.43%~99.74%,相对标准偏差为2.48%~5.26%,无机硒的回收率达到92.25%~95.36%,相对标准偏差为2.73%~6.10%,以上结果表明,测定总硒及无机硒的方法准确度高,重复性好,通过差减法得到的样品的有机硒含量是真实可信的,同时国家标准物质测定值在标准值允许误差范围内,说明该方法准确、可靠,能够满足水产品中总硒的检测要求。二、采用氢化物原子荧光法(HG-AFS)分析不同地区刺参总硒和无机硒的含量及分布规律人体内的硒元素主要是通过吸收食物中的硒而获得,并通过机体的代谢过程将其转化为机体所能利用的形式。而水产品刺参体内的硒含量较高,尤其是可被机体利用的有机硒的含量相当丰富。但刺参体内硒的研究还是比较薄弱,刺参各组织中有机硒和无机硒的比例如何、不同组织间和不同地区间硒含量有何差异以及硒对刺参的生物学作用等方面还缺乏相关研究。本研究旨在探明环境中硒对刺参体内硒含量的影响及不同形态的硒在各组织中的富集代谢情况,为进一步进行分子生物学方面的研究提供参考。本文首次以黄渤海域大连、东营、烟台、青岛、日照五个典型地区刺参群体为研究对象(取样时间为2014年4月份),应用氢化物原子荧光法对刺参体内不同组织硒形态分布进行了初步分析,并比较了不同地区间及不同组织间硒含量差异。结果显示,呼吸树为总硒和无机硒含量最高的组织,平均值为14.17±3.41mg/kg和6.19±3.83mg/kg,不同组织内的总硒、无机硒含量变化呈现一致的规律,硒含量由高到低为:呼吸树>消化道>肌肉>内壁>外壁,同时刺参体壁和肌肉(食用部分)中有机硒比例在75.63%~89.41%之间(除东营地区刺参群体肌肉组织的有机硒比例最低为53.64%);五个地区刺参群体同一组织内的总硒及无机硒含量均有显著性差异,东营地区呼吸树、消化道和肌肉中无机硒含量较高。三、不同水平的外源硒对刺参生物学指标及硒含量的影响对于水产动物而言,元素硒同样具有多种重要的生理功能。刺参养殖过程中,大量用药及滥用抗生素类药物严重危害人类的健康,带来细菌耐药性及药物残留引起的环境污染等问题。研究表明适量添加外源硒可以增强水产动物的免疫功能,从而提高其抗病能力。本文开展了不同硒浓度的养殖实验,通过测定刺参成活率及相关酶的活性来研究硒对刺参的生物学影响,旨在探索硒在提高刺参的健康指标的作用;此外,通过测定刺参不同组织的硒含量,以探讨硒在体内的分布及转化问题,发现刺参体内的硒含量变化规律,同时获得高活性的有机硒,缓解缺硒现状。本文以我国北方重要养殖经济品种刺参为研究对象,采取逐级放大的方法进行在饲料中添加不同硒浓度梯度(0mg/kg、0.20mg/kg、0.40mg/kg、0.80mg/kg、1.60mg/kg、3.20mg/kg、6.40mg/kg)的富硒酵母的养殖试验,养殖4W后测定刺参的生物学指标及硒含量变化。结果显示:添加适宜浓度硒可以提高刺参的成活率(最高达100%)及消化酶的活性,蛋白酶、淀粉酶活性最高分别为35.13U/mg prot、0.51U/mg prot,分别为对照组的2.45、2.07倍;硒对提高刺参的免疫酶活性有明显的促进作用,刺参各组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽挂氧化物酶(GSH-Px)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)分别在硒浓度为0.80~1.60mg/kg时达到最高,显著高于其他各组;同时刺参各组织中的硒含量均有不同程度的上升,且有机硒的提高倍数远远大于无机硒的提高倍数,说明富集到体内的以有机硒为主。结果表明:当硒浓度为0.80~1.60mg/kg时,实验刺参的养殖效果最佳。