骨缺损是临床中常见疾患，传统治疗手段主要是通过自体骨、同种异体骨或异种骨移植达到骨缺损的修复。以上方式存在供体受限、免疫排斥反应以及疾病传播等问题。近年来，基因工程和组织工程技术的不断发展，为临床骨缺损修复提供了更多的治疗选择。利用组织工程骨修复大段骨缺损成为目前研究的热点。组织工程骨的构建包括种子细胞、支架材料以及细胞因子三大要素。体外构建的组织工程骨是细胞与材料的复合体，自身无营养来源，植入体内后，需血液-细胞间液为种子细胞提供营养。若植入区血供不良或植入物血管化过程较长，附着在支架上的种子细胞可因缺乏营养而出现代谢紊乱，细胞增殖、分化及分泌功能受损甚至死亡，最终导致移植物失效而变为单纯的骨传导材料，成骨能力下降。因此，组织 3 <WP=9> 重庆医科大学博士学位论文工程骨植入体内后的快速血管化，是保证植入物中种子细胞成活、增殖、分泌，最终达到加快骨缺损修复的前提。目前，该方面的研究尚处于起步探索阶段。 本实验拟采用体外构建的 VEGF 基因修饰组织工程骨，植入兔大段骨缺损区，观察、检测其在体内的再血管化及促进骨缺损修复的作用。 本实验从五个方面进行研究，主要方法、结果及结论如下：1. 生物衍生骨支架材料—脱蛋白骨的制作及检测 将新鲜成年新西兰大耳白兔干骺端松质骨，采用过氧化氢-乙醚法制作生物衍生骨材料－脱蛋白骨（DPB）。经倒置相差显微镜、扫描电镜观察及多项理化指标检测，证实用该法制得的 DPB 具有与原骨组织基本相同的孔隙－网架三维结构系统，其孔径、孔隙率、孔间交通率以及孔内表面结构均符合组织工程骨的要求，材料中蛋白质、脂质成份基本被完全去除，消除了免疫源。由松质骨来源制作的 DPB 是一种较理想的组织工程骨支架材料。2. 兔成骨细胞的分离、培养和鉴定 将出生前 1 周胎兔的颅骨组织，采用酶消化－组织块联合培养法分离、培养出原代成骨细胞并进行传代培养。经对细胞进行镜下形态学观察、细胞化学及酶学等鉴定，证实本实验所分离培养出的细胞为成骨细胞，具有良好的增殖生化能力。经对传代培养和冻存复苏后培养的成骨细胞进行观察，其细胞形态学特征及增殖分化能力与原代细 4 <WP=10> 重庆医科大学博士学位论文胞无明显差异。是构建组织工程骨较理想的种子细胞。3. pEGFP/VEGF121 重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达 以人胎脑文库为模板，通过 PCR 方法扩增出人 VEGF 121 基因，构建入增强绿色荧光蛋白 pEGFP-C1，成功构建重组质粒 pEGFP/VEGF121。经酶切鉴定和测序报告分析，证实质粒构建的正确性。脂质体法体外转染成骨细胞，荧光显微镜观察及 ELISA 法检测证实，重组质粒可在成骨细胞表达 VEGF 蛋白，证明该重组质粒构建成功。4. 组织工程骨的体外构建 将第4代成骨细胞和转染VEGF基因的成骨细胞分别与DPB支架材料在体外复合培养。DPB 材料在接种前经预湿处理，细胞悬液的配制选用处于对数生长期细胞，每个材料中接种细胞数为 6×105 。通过消化法、倒置相差显微镜和扫描电镜观察，证实两种细胞与 DPB 经体外复合培养后，在 DPB 材料外表面、孔内表面均有生长。随培养时间的延长，材料中细胞数量也随之增多，并出现细胞间连接融合，部分细胞有伪足伸出与材料表面呈锚着状生长。由此表明，本实验中制作的生物衍生骨支架材料 DPB 与成骨细胞具有良好的细胞相容性。体外成功构建了组织工程骨和 VEGF 基因修饰组织工程骨，为下一步应用于兔大段骨缺损修复奠定了基础。5. VEGF 基因修饰组织工程骨体内再血管化及成骨活性观察 将兔大段骨缺损模型分为 A、B 两组进行实验。兔双侧桡骨中段切取 15mm，制备大段骨缺损模型。A 组缺损区左侧植入单纯 DPB 材 5 <WP=11> 重庆医科大学博士学位论文料作为对照侧，右侧植入组织工程骨作为实验侧；B 组左侧缺损区植入物与 A 组实验侧相同，右侧缺损区植入 VEGF 基因修饰组织工程骨。在 1、2、4、6、12W，采集 A、B 两组植入物分别行 1.血生化指标检测；2.大体标本观察；3.组织形态学观察；4.超微结构观察；5.微血管墨汁染色观察；6.VEGF 免疫组化检测；7.骨矿含量测定；8.RT-PCR检测 VEGF 基因转录水平等。 本部分实验结果表明， VEGF 基因修饰组织工程骨，在植入动物骨缺损区后，第 1 周植入物周围及材料内部即形成大量网状细小血管，并在第 2 周继续保持较多水平，随后血管逐渐增粗、减少、纵向走行；组织工程骨血管形成情况较之滞后 1 周以上，单纯 DPB 材料则更差。VEGF 蛋白表达在第 1 周最高，随后逐渐下降，渐于正常。骨形成以VEGF 基因修饰组织工程骨最快，较组织工程?