研究背景：学习和记忆是中枢神经系统高级活动的一种方式,是高等动物和人类认知的基础,也是动物赖以生存和进化发展的关键。学习是对新信息和新知识获取的神经过程,而记忆则是对所获取信息的保存和“读出”的神经过程。学习和记忆是相互联系的、不可分割的两个过程。学习记忆的神经生物学基础是中枢神经系统的可塑性,包括神经网络、神经环路及突触连接等不同水平的可塑性,其中突触可塑性尤为重要。突触可塑性是指突触在一定条件下调整功能、改变形态和增减数目的能力,包括突触传递效能和突触形态结构的改变。其变化主要有：(1)突触前修饰,包括神经递质的合成、贮存、释放及自身受体功能的改变；(2)突触后修饰,包括受体激活第二信使、G蛋白、膜离子流及磷酸化和脱磷酸化等各种变化；(3)突触前或突触后结构的可塑性,包括突触界面曲率、突触后致密物质、树突棘等的变化；(4)非神经元的修复。突触可塑性的主要表现形式—长时程增强(Long-term potentiation LTP)和长时程抑制(Long-term depression LTD)现象已被公认为是学习记忆活动细胞水平的生物学基础。LTP首先在哺乳动物的海马(CA1区)和齿状回被观察到,是指突触前神经元受到短时间的快速重复刺激后,在突触后神经元快速形成的持续时间较长的兴奋性突触后电位增强,表现为潜伏期缩短、幅度增高、斜率加大。LTP的产生机制可分成三个阶段：诱导阶段,即诱导产生LTP；表达阶段,即LTP最初出现的时期,持续几分钟到几小时；维持阶段,即增强的反应继续表达的长时间持续阶段。阿片肽主要有3种,脑啡肽、内啡肽和强啡肽,其中脑啡肽是中枢神经系统含量最高的内源性阿片肽,与学习记忆功能关系极为密切。1975年,Hughes等首次从猪脑中提取并发现内源性阿片样物质,随后又纯化并研究确定此类阿片样物质包含两种五肽,甲硫氨酸脑啡肽(Methionine enkephalin, MET-ENK)和亮氨酸-脑啡肽((Leucine-enkephalin, LEU-ENK))。大量研究发现脑啡肽与学习记忆密切相关。Kastin等首次报道腹腔注射MET-ENK可提高大鼠复杂迷宫实验记忆的保持。MartinezJ等研究发现LEU-ENK类似物DADLE增强大鼠被动回避反应的习得,而损害小鼠趋食Y-迷宫记忆的保持阶段。Henk Rigter等发现外周注射LEU-ENK或MET-ENK均可减轻二氧化碳诱导所致的实验性健忘。腹腔注射LEU-ENK (400ug/kg)或其类似物D-Ala-D亮氨酸-脑啡肽(4ug/kg)均会损害大鼠的主动逃避反应的获得。Sweis等发现慢性压力致记忆损害轻的大鼠较记忆损害严重的大鼠脑脑啡肽表达明显上调,认为脑啡肽有希望作为减轻慢性压力导致的记忆损害的干预靶点。MeilandtwJ等发现转基因阿尔茨海默病模型小鼠内嗅皮层和齿状回的MET-ENK明显升高,并推测脑啡肽的升高可能对阿尔茨海默病模型小鼠、甚至阿尔茨海默病人的认知有损害作用。自从1957年Scoville报道了一位双侧颞叶切除的病人出现了严重的近期记忆丧失,至此Lashley的学习记忆弥漫地储存在脑内学说的统治地位逐渐崩析瓦解。50多年来对学习记忆相关脑区的研究发现,不同学习记忆相关脑区在不同的学习记忆类型中扮演着不同的角色。目前认为与学习记忆有关的重要脑区包括海马、前额叶皮层、小脑、杏仁体、Meyne-基底核和大脑皮层等。损害内侧颞叶记忆系统(由海马及相邻有关皮层等构成)可导致顺行性和逆行性遗忘。前额叶皮层与工作记忆密切相关,主要包括3个神经环路,其中背外侧前额叶环路介导执行行为、眶额环路介导社会行为、内额叶环路参与动机的形成。小脑在运动技巧的学习和空间认知活动中起重要作用。早期学习记忆功能障碍几乎均责之于大脑皮质,但随着许多病位不在大脑皮质的疾病如亨廷顿病(Huntingtong’s disease, HD)和帕金森病(Parkinson’s disease,PD)也同样出现记忆障碍,提示皮质下结构也可能是一些高级认知功能的重要神经基础。随后发现杏仁核病变会阻断动人或动物新的条件反射形成或旧的条件恐惧反射的表达。Meynet基底核参与了Alzheimer病的形成,是Alzheimer病肯定的损害。纹状体边缘区(the marginal division, MrD)是新近发现的恰好位于大脑几个已知学习记忆结构(间脑、海马、新皮层)中心的一个皮质下学习记忆相关脑区。1988年舒斯云等用生物凝集素标记法和免疫辣根过氧化物酶染色法在大鼠脑内新纹状体尾内侧边缘、包绕苍白球外侧的位置,新发现了一个由密集梭形细胞组成的带状结构,其细胞形态、神经递质含量和超微结构等都与纹状体其他部分很不相同,后又相继在猫、猴和人脑内相应部位发现MrD的存在,证明MrD是哺乳动物脑内普遍存在的结构,且动物越高级MrD越发达。用免疫组化染色法发现大鼠脑纹状体MrD内脑啡肽、强啡肽B和、P物质(substance P, SP)免疫反应阳性终末和含锌纤维比纹状体其他部位多,还富含N-甲基-D-门冬氨酸(NMDA)受体、蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)、钙神经素、环磷酸腺苷反应单元结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)等多种学习记忆相关物质。纹状体MrD的传入纤维主要来自黑质外侧及背外侧部,发出的纤维投射到Meynet基底核和黑质等处。用分子生物学和免疫组织化学发现纹状体MrD是边缘系统新的组成部分。该区与脑内包括海马、杏仁核、Meynet氏基底核和前额叶皮质等多个学习记忆相关脑区存在着结构和或功能上的联系,大鼠双侧MrD化学性损毁后行双盲Y迷宫试验结果发现大鼠出现了严重的学习记忆功能障碍,对健康人和纹状体MrD损害病人进行行为学测试和脑部功能核磁共振研究均证明了MrD有学习记忆功能,MrD参与了听觉数字工作记忆、中文配对词语联想学习记忆、中英文书写、数字计算和空间记忆的脑功能活动。基于以上理论,本研究拟对成年雄性恒河猴常规灌注固定和取脑,冰冻切片后行免疫组织化学反应检测纹状体MET-ENK的表达,然后取纹状体MrD内免疫组化阳性反应区进行超微切片,电镜下观察MrD内MET-ENK样免疫反应神经终末突触的超微结构,为进一步探索纹状体MrD的学习记忆功能提供超微结构基础。研究目的：1、通过解剖形态学观察猴纹状体MrD在位置和形态特征。2、免疫组织化学后行葡萄糖氧化酶-二氨基联苯胺-硫酸镍铵染色,电镜下观察纹状体MrD学习记忆相关物质MET-ENK样免疫反应阳性神经终末的超微结构,进一步了解学习记忆相关脑区-纹状体MrD的超微结构研究,为学习记忆提供超微结构基础,为以后研究学习记忆障碍相关疾病的诊断治疗提供新思路。实验方法：将6只雄性恒河猴用戊巴比妥麻醉,生理盐水经心脏灌注后,用含有40g/L多聚甲醛、1g/l戊二醛和2g/L苦味酸的0.1mol/L磷酸盐缓冲液固定灌注,将脑取出,浸泡至40g/L的多聚甲醛中,置4℃冰箱中固定28h。在恒冷箱切片机上将猴脑组织块切片至50u m厚度,将脑组织浸入含20%蔗糖的磷酸缓冲液使脑组织沉底。用磷酸缓冲液冲洗后置入稀释1：3000的抗MET-ENK兔血清中,在4℃孵育36h。在用磷酸缓冲液稀释的生物素结合的羊抗兔IgG室温下孵育12h。在抗生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物技术(Vector ABC kit)进行免疫反应,室温孵育4h,用葡萄糖氧化酶-二氨基联苯胺-硫酸镍铵(GDN)方法显示免疫反应物。MET-ENK阳性切片在1%戊二醛中固定30min,磷酸缓冲液漂洗后,置于1%锇酸中固定30min。经梯度酒精脱水后在环氧丙烷中脱水,在EPON816中室温过夜。将切片置于涂有Teflon的两块硅化玻璃载片之间,在37℃、45℃及60℃各聚合一天。在光镜下观察含密集的MET-ENK神经终末的MrD,并在体视镜下切取该区,用Cyanoacrylate胶粘在EPON块尖端,超薄切片机切片,1%枸橼酸铅染色,JEOL-2000EX电镜观察。结果：1、免疫组织化学染色检测恒河猴脑纹状体MET-ENK的表达光学显微镜下可见壳核染色浅,苍白球外节内大量MET-ENK阳性表达物质,染色呈浓黑斑块状,苍白球内节几乎未见MET-ENK免疫反应阳性物质分布,呈白色。在壳核和苍白球之间有一条密集排列的MET-ENK免疫反应阳性细胞带,沿与壳核内侧边界平行方向走行,其染色比苍白球外节浅,但较壳核其他部位深,呈明显的紫蓝色免疫阳性反应产物条带,在免疫反应阳性带中,含有散在的梭型的免疫阳性细胞,此区即恒河猴纹状体MrD(图1)。2、电镜观察恒河猴纹状体MrD的超微结构电镜下可见MrD神经元为长梭形或纺锤形,核大呈卵圆形常居中、染色浅,核周体细胞器较少、色淡,有少量线粒体、核糖体和粗面内质网不均匀地散布在胞浆中,核仁明显,细胞核透亮度好,箭头所示为胞体左侧有几个MET-ENK免疫反应阳性轴突和胞体形成轴-体突触(图2)。电镜下MET-ENK免疫反应阳性树突、轴突、胞体、树突棘主要形成5个类型的突触连接。(1)轴-树突触MET-ENK免疫反应阳性轴突终末与树突主要形成对称性突触(图3A),轴突终末内多为中等大小椭圆形或多形性囊泡,常可见线粒体存在。也可见1个阳性轴突与2个或以上树突形成复合型对称性突触(图3B)。偶可见1个轴突终末在1个树突干断面形成2个甚至以上突触活性点(图3C)。(2)轴-棘突触观察到的MET-ENK免疫反应阳性轴突与树突棘形成轴-棘突触,轴-棘突触均为非对称性突触(图4),轴突终末内多含有小或中等大小圆形清亮突触囊泡。MET-ENK免疫反应阳轴突终末与多个树突棘形成复合型非对称性突触也很常见(图4A)。还可观察到MET-ENK免疫反应阳性轴突终末与1个树突棘形成2个非对称性突触(图4B)。(3)轴-体突触MET-ENK免疫反应阳性轴突终末与神经元胞体可形成对称性轴-体突触(图5A),也可形成非对称性轴-体突触(图B)。(4)轴-轴突触观察到两种类型轴-轴突触,其中一种突触的2个轴突终末均含有MET-ENK免疫反应阳性物质,轴突间形成2个突触活性点,同时它们还分别与1个未标记神经元胞体形成对称性轴-体突触(图6A)。另一种突触的MET-ENK免疫反应阳性轴突终末与2个未标记的轴突终末均形成对称性轴-轴突触(图6B)。根据超微形态推测,轴-轴突触属于抑制性突触。(5)复合型突触复合型突触是指1个突触结构中包含有3个以上的神经成分。本实验观察到纹状体MrD存在大量复合型突触。1个未标记的树突棘与1个MET-ENK免疫反应轴突终末形成非对称性突触,同时,此MET-ENK免疫反应轴突终末与1个未标记的神经元胞体也形成了非对称性突触,即棘-轴-体复合型突触(图7A)。1个MET-ENK免疫反应轴突终末分别与2个树突和1个树突棘形成的复合型突触,且均为对称性突触。(图7B)复合型突触显示边缘区功能的复杂性。结论：学习记忆新区-纹状体MrD内MET-ENK免疫反应阳性轴突终末突触具有多样性和复杂性,主要有轴-树突触、轴-棘突触、轴-体突触、轴-轴突触以及多种复合型突触。MrD与纹状体其他区在学习记忆中发挥不同的作用,可能与其超微结构差异有关。纹状体MrD内ENK及其作用机制有待进一步研究。