研究背景唇形科(Labiatae)香茶菜属(Isodon)植物系多年生草本、灌木或半灌木植物,全属约计150余种,供药用的有30余种,具有清热解毒、健脾活血、抗菌消炎等功效,某些种类民间作为抗癌药用。生物活性研究结果表明该属植物具有的生物活性广泛,从中提取分离得到的多个二萜类成分具有显著的抗肿瘤活性。显脉香茶菜Isodon neivosus(Hemsl.)C.Y.Wu et H.W.Li系唇形科香茶菜属多年生草本植物,民间以全草入药,具有清热、除湿、解毒等功效。从显脉香茶菜中分离出的一系列二萜类化合物中,属于α-亚甲基环戊酮单元对映-贝壳杉烷型的二萜类化合物显示出良好的抗肿瘤活性。Nodosin,为6,7断裂-对映-贝壳杉烷型五环二萜化合物,是从显脉香茶菜中分离出的天然对映-贝壳杉烷型二萜,对人慢性粒细胞白血病K512细胞、人白血病HL60细胞、人结肠癌LOVO细胞、乳腺癌MCF-7细胞、神经母细胞瘤SHSY5Y细胞、小鼠B16-F10黑色素瘤细胞、急性早幼粒细胞白血病NB4细胞、肺癌A549细胞和前列腺癌细胞PC-3均具有不同程度的抑制或杀伤作用。Nodosin对胶质瘤细胞的生长也具有明显的选择性抑制作用并对胶质瘤细胞具有细胞增殖抑制作用,对大鼠胶质瘤C6细胞和人胶质瘤U87细胞的IC50分别是25.81μM、11.05μM.本课题前期研究发现这种作用通过阻滞细胞周期于G2/M期以及下调cyclinB1和cdc2蛋白水平来实现。同时,nodosin具有诱导胶质瘤细胞凋亡的作用,并能通过促进细胞微管解聚以及下调MMP-9蛋白水平来抑制胶质瘤细胞的迁移侵袭。同时,前期研究首次在体内实验中发现nodosin能抑制裸鼠内胶质瘤的肿瘤生长及减少肿瘤重量,具有体内抗恶性胶质瘤作用。到目前为止,有关单体化合物nodosin在体内的吸收、代谢等相关药代动力学特征尚不清楚。为满足新药的研究与开发需要,本课题建立了利用HPLC-MS/MS测定生物样品中nodosin含量的方法,用以对nodosin在大、小鼠体内开展系统的药代动力学探索性研究。研究目的本项研究目的在于在本实验室前期对nodosin体内、外抗恶性胶质瘤的研究基础上,进一步进行nodosin在小鼠体内的吸收、分布及在大鼠体内的吸收、排泄研究,探索nodosin的药代动力学。首先通过HPLC-MS/MS手段建立一个简单、灵敏专属性强的测定生物样品中nodosin含量的方法,利用此方法测定大、小鼠的血药浓度来研究nodosin的吸收及其相关的药代动力学参数；其次通过测定小鼠肝脏及脑组织中nodosin的含量来研究其在肝脏里面药物的分布情况及其是否透过血脑屏障；最后通过测定大鼠尿液和粪便中nodosin的含量来掌握其排泄情况。研究方法首先实验选择齐墩果酸作为内标化合物并优化色谱及质谱条件,建立一个HPLC-MS/MS测定生物样品中nodosin含量的方法。利用液液萃取法进行生物样品的前处理,考察不同的萃取溶剂、溶剂量及萃取时间对液液萃取法进行优化,参考文献考察在样品处理过程中对基质效应及回收率影响的因素,得到最优的样品处理方法,最后进行专属性、精密度、回收率等方法学验证。其次进行大、小鼠体内实验,实验设计SD大鼠和KM小鼠单次腹腔注射nodosin生理盐水(1 mg·kg-1),给药后于不同时间点(段)采集生物样品,并用LC-MS/MS测定生物样品中nodosin的浓度,最后通过DAS3.2.6药动学软件计算nodosin药动学参数。研究结果(1)建立了一个灵敏度高、专属性强的HPLC-MS/MS测定生物样品中nodosin含量的方法。结果显示nodosin在3.9～1000 ng·mL-1浓度范围内线性关系良好(r2>0.99),定量限为3.9 ng·mL-1。提取回收率在74.2%以上,日内和日间精密度RSD均小于9.8%,准确度RE范围在-1.6%～10.8%之间。表明该方法灵敏度和准确度高,成熟稳定,能够满足分析大量样品的需要。(2)通过动物实验确定了nodosin在大鼠体内的吸收、排泄和在小鼠体内的吸收、分布及情况。在小鼠的脑组织中未能测到nodosin的含量,确定nodosin不能直接透过小鼠血脑屏障。大鼠腹腔给药后,1%的nodosin以原形的形式从尿液和粪便排出。