前言重症胰腺炎是临床上多见的危重疾病，本病一旦发生，无有效方法遏制其进展，死亡率极高，即使病人最终存活，也常因胰腺等重要器官的损伤而留下胰腺内外分泌功能障碍等并发症，严重影响生存质量。目前国内外ANP的研究多集中在控制感染、提高生存率方面，但疗效不能让人满意。自1988年Rindermecht提出急性胰腺炎的白细胞过度激活学说以来，免疫机制在急性坏死性胰腺炎中的重要作用已经得到了广泛的认同，抑制ANP的过度免疫反应的治疗方法也因此成为最有希望和前景的方法。20世纪90年代提出了关于SIRS发生机制的“二次打击”(two-hit)理论，该理论认为创伤、失血、休克等为第一次打击，其后感染或非感染性损伤对免疫系统的冲击构成第二次打击诱发SIRS。因此我们认为：各种刺激构成对机体第一次打击形成轻型胰腺炎，而在一定时间范围内以适当的量出现的各种类型的抗原冲击免疫系统构成了二次打击，引发了细胞因子的级联反应，即“轻型胰腺炎+二次打击的抗原刺激，导致ANP的发生。轻型胰腺炎模型建立后如果给予LPS或大量细菌可以制成ANP模型便是以此为依据，验证了该解释的合理性。超抗原(SAG)是一类可与抗原呈递细胞(APC)上的MHC-Ⅱ类分子和T细胞受体(TCR)结合而刺激T细胞活化增殖的抗原，主要由一些微生物产生。超抗原最显著的特点就是只需要极低浓度即可激活2％-20％的T细胞，产生极强的免疫应答。既然SAG来源于微生物而且很小的量既可发生免疫反应，这就为ANP发生的二次打击提供了可能。近年来，许多科学家对超抗原进行了大量的研究，发现它与多种疾病如：毒性休克综合征、川崎综合征、及一些皮肤病等的发生发挥了重要的作用。但SAG在急性坏死性胰腺炎中的作用尚未见报道。所以我们着手在此方面的研究。通过观察小鼠轻型胰腺炎时SAG二次打击小鼠ANP的发生及其血清淀粉酶及细胞因子IL-1β的表达，来阐明超抗原在急性坏死性胰腺炎中的作用。实验材料与方法一、实验材料1、主要药物与试剂雨蛙素(Sigma公司产品，美国)超抗原SEB(军事医学科学院微生物研究所，北京)IL-1β试剂盒(晶美公司产品，上海)2、主要仪器与器材法国水平转头离心机CR411自动酶标检测仪Model 450，Bio-Rad产品深低温冰箱Kelvinator 100，美国3、实验动物BALB／C小鼠40只(上海斯莱克实验动物有限责任公司)二、实验方法1、实验动物分组：BAVB／C小鼠40只，体重17——20克。随机分为8组，1个空白对照组，1个SEB组，3个雨蛙素组(分别为轻型胰腺炎形成后5，24，72小时)，3个SEB+雨蛙素组(分别为轻型胰腺炎形成后5，24，72小时)。每组5只。2、实验模型的建立受试动物实验前禁食18小时，自由饮水。空白对照组：给予小鼠腹腔注射生理盐水。SEB组：给予SEB500μg／kg腹腔注射。雨蛙素组：采用雨蛙素腹腔注射(50μg／kg，每小时一次，共5次)制成轻型胰腺炎。雨蛙素+SEB组：分别在轻型胰腺炎建立后(3，22，70小时)，给予SEB500μg／kg腹腔注射。3、标本的采集及处理小鼠取血：取血后静置20分钟取上清离心，再取上清负20度冰箱保存待测。胰腺组织：取完整胰腺组织5％甲醛溶液固定。正常对照组：直接取材。SEB组：给予SEB500μg／kg腹腔注射后2小时取材。雨蛙素组：分别在轻型胰腺炎形成后(5，24，72小时)取材。雨蛙素+SEB组：在轻型胰腺炎形成后(3，22，70小时)给予SEB 500μg／kg刺激2小时后取材。4、血清淀粉酶测定：生化法5、IL-1β检测：双抗体夹心ILISA法6、组织学检查：HE染色7、组织学评分标准水肿：无0分、局限性小叶间距离增加1分、弥漫性小叶间距离增加2分、腺泡破坏和分离3分；炎性浸润：无0分、导管周围炎性浸润1分、实质内(小于50％小叶)2分、实质内(大于50％小叶)3分；腺泡坏死：无0分、导管周围坏死小于5％1分、局限性坏死5％—20％2分、弥漫性坏死20％—50％3分。8、统计分析统计学处理SPSS10.0软件行t检验，两两比较。检验水准为0.05。实验结果一、大体观察见——SEB组：未见明显异常；雨蛙素组：胰腺组织显著肿胀，体积增大是正常的2—3倍，包膜紧张，色苍白，胰外器官无明显异常；雨蛙素+SEB组：胰腺肿胀，色灰暗，有点状出血，表面有少许皂化斑，尤以轻型胰腺炎建立后24小时最为明显。二、血清淀粉酶和细胞因子IL-1B的变化——SEB组：小鼠的血清淀粉酶和细胞因子IL-1β的含量较对照组有所升高；雨蛙素组：小鼠的血清淀粉酶和细胞因子IL-1β在开始时逐渐升高，24小时达高峰，以后逐渐下降；雨蛙素+SEB组：在接受SEB刺激后，血清淀粉酶和IL—1β比雨蛙素组显著升高，尤以24小时明显。三、组织学检查见——SEB组：未见明显异常；雨蛙素组：5次腹腔注射雨蛙素后既可见胰腺组织内的水肿，炎细胞的浸润，24小时最为明显，以后逐渐减轻；雨蛙素+SEB组：可见胰腺组织出血坏死，24小时最为明显。讨论在急性坏死性胰腺炎的发病机制中，免疫机制受到越来越多学者的关注。研究显示：胰酶激活是ANP的始动原因，而此时细胞因子分泌增加，以巨噬细胞为源头的免疫系统处于应激状态，如果接受到合适的抗原刺激，极易引起细胞因子级联反应，形成免疫瀑布，发生急性坏死性胰腺炎。金畅等用雨蛙素联合脂多糖制成小鼠重症急性胰腺炎模型便是以此为依据。超抗原是某些细菌和病毒产生的一类具有多种免疫活性的蛋白分子，很小的量既可激活免疫系统，发生免疫反应。超抗原的免疫识别和普通抗原不同，它不需要抗原递呈细胞的内处理，而是以完整蛋白质的形式直接与MHC-Ⅱ抗原结合槽的外侧特异性结合，以TCRVβ特异方式激活比普通抗原高达10~3—10~5倍的T淋巴细胞，引起大量细胞因子分泌，导致免疫系统紊乱而致病。业以证明超抗原在多种感染性疾病、自身免疫病、肿瘤甚至爱滋病的发病机制中起重要作用。如：毒性休克综合征、川琦综合征、类风湿性关节炎等。但超抗原在急性坏死性胰腺炎的研究中还未见报道。本实验就是通过超抗原在急性胰腺炎病情变化中的影响，来研究超抗原在急性坏死性胰腺炎中的作用。在实验中，使用超抗原SEB腹腔内注射给药，可以使小鼠细胞因子分泌增加，但胰腺的组织病理学检查未见明显变化，不能形成ANP。而雨蛙素联合超抗原SEB腹腔注射给药，则成功制成小鼠急性坏死性胰腺炎模型。实验结果说明：单独使用超抗原虽然可以激活T淋巴细胞，引起细胞因子分泌增加，但不能激活正常状态下的中性粒细胞发生细胞因子级联反应，不能形成ANP。而在雨蛙素形成轻型胰腺炎模型后，再给予超抗原SEB刺激后，制成了ANP模型，说明当T淋巴细胞被激活引起细胞因子分泌后，超抗原可以引起处于应激状态下中性粒细胞发生细胞因子级联反应，爆发ANP。此实验不仅证实了“轻型胰腺炎+二次打击”形成ANP的理论，同时也说明了超抗原SEB能激活应激状态下的免疫系统，释放大量的细胞因子，促进全身炎症反应的发生。本实验采用雨蛙素联合超抗原SEB腹腔内注射，建立了一种非创伤性的ANP模型。并且研究了轻型胰腺炎形成的基础上，超抗原二次打击后，细胞因子、血清淀粉酶的表达及胰腺组织学评分与胰腺炎病情进展的关系。结果发现：轻型胰腺炎形成后，给予超抗原SEB刺激，可以产生ANP，以急性胰腺炎的早期明显，尤在轻型胰腺炎形成后24小时最为显著。分析这种现象出现的原因：①急性胰腺炎是一种自身代偿机制无法平衡的严重炎症反应。当细胞因子被过度激活，保护机制减弱，再受到合适的刺激后就将形成ANP。②轻型胰腺炎在24小时细胞因子达到高峰，此时受到抗原刺激，最易导致细胞因子级联反应的发生，产生急性坏死性胰腺炎。此实验证实了“轻型胰腺炎+二次打击”形成ANP的理论。如果能在二次打击之前采取有效的措施稳定应激的免疫细胞，使之接受二次打击后不会进一步激发炎症反应，形成免疫瀑布，则可避免ANP的发生。而如何在二次打击之前对免疫细胞进行修饰，达到预防ANP的发生，是我们在以后的研究中需要解决的课题。结论1、证实了“轻型胰腺炎+二次打击”产生ANP的理论。2、在轻型胰腺炎的早期，尤其是在细胞因子分泌高峰24h时，SEB的刺激急性坏死性胰腺炎的发生最为明显。3、超抗原能激活应激状态下中性粒细胞发生细胞因子级联反应，爆发ANP。