背景胰腺癌是目前已知的恶性度最高的肿瘤之一,由于缺乏有效的早期诊断手段,外科切除率低；而保守治疗如化疗和放疗的疗效也不佳,5年总体生存率不到5%。目前尚无一种理想筛选早期胰腺癌的肿瘤标志物,而且已报道的可用于胰腺癌的靶向药物厄洛替尼、西妥昔单抗、贝伐单抗疗效并不尽人意。因此探索胰腺癌的新的诊断和治疗靶分子显得尤为重要。近年来针对胰腺癌相关细胞信号通路的研究愈来愈深入,与胰腺癌相关的细胞信号通路包括：RAS-RAF-MAPK通路、PI3K/AKT通路、NF-κB通路、EGFR通路、TGF-β通路、WNT通路、Hedgehog (Hh)通路、Notch通路、STAT通路以及黏蛋白信号通路等。这些信号通路都可以影响肿瘤细胞增殖或凋亡,在肿瘤发生、发展中发挥重要的作用。其中RAS信号通路是胰腺癌发病机制中主要通路之一,也是本实验主要探讨的信号通路。RAS蛋白是RAS基因表达产物,是由190个氨基酸残基组成的小的单体GTP结合蛋白,具有GTPase活性,分布于质膜胞质一侧,共有三种：H-RAS, N-RAS, K-RAS。通常情况下,RAS存在着两种循环状态,失活的RAS-GDP状态和活化的RAS-GTP状态。RAS-GEFs和RAS-GAPs是能够调节这两种循环状态的两类分子。RAS-GEFs促使RAS-GDP转化为活化状态的RAS-GTP,开放RAS信号通路；而RAS-GAPs的作用正好相反,它通过增加RAS蛋白内在的GTPase活性,水解RAS-GTP形成RAS-GDP非活性形式,关闭RAS信号通路实施负调控作用。而RAS基因突变后,其内在GTP酶活性丧失或者蛋白分子构象会发生改变,失去与RAS-GAP的结合能力,RAS蛋白始终以RAS-GTP活化形式持续不断地启动和放大细胞内信号通路,引起肿瘤不断增殖。相比之下,RAS-GAP与野生型RAS的亲和力更高,所以RASGAP仅在KRAS野生型的肿瘤中发挥作用。而当RAS-GAP表达缺失或降低表达时,也可以活化RAS信号通路,导致细胞生物学行为的异常。尽管胰腺癌以KRAS突变型为主,但对于KRAS野生型肿瘤,近年来相关研究报道较少。野生型RAS及它所调控的RAS信号通路在肿瘤发生发展中的作用机制尚不十分清楚。最近有文献报导在这类肿瘤中同样存在RAS蛋白过度活化以及RAS信号通路的调节异常。因此推测其原因可能与RAS基因表达的抑制物如RAS-GAP的下调或其作用缺失有关。目前已经发现的RAS-GAPs总共有16种：DAB2IP,RASAL1. RASAL2, RASAL3, RASA1, RASA2, RASA3, RASA4,IQGAP1, IQGAP2, IQGAP3, SYNGAP1, GAPVD1, ARHGAP5, G3BP1, NF1。近年来关于RASGAP与肿瘤之间联系的研究引人注目。现有研究表明DAB2IP在肝癌、前列腺癌及肺癌中表达下降,并具有肿瘤抑制功能,被认为是一种抑癌基因。但DAB2IP在胰腺癌中的表达水平以及在胰腺癌发生发展中的作用目前尚不清楚。目的检测胰腺癌细胞中RAS-GAPs的表达谱,筛选出在KRAS野生型和突变型细胞中表达差异显著的DAB2IP作为研究靶分子。再进一步检测DAB2IP在胰腺癌细胞和胰腺癌组织中的表达水平,探讨其在胰腺癌中的可能作用和临床意义,随后通过下调KRAS野生型胰腺癌细胞中的DAB2IP表达水平,进一步验证其在KRAS野生型胰腺癌发展中可能起的作用,从而阐明DAB2IP在胰腺癌发生发展过程中可能存在的分子机制,为胰腺癌诊断与治疗寻找到新的靶分子。方法1.所有胰腺癌细胞(KRAS野生型：Bxpc-3;KRAS突变型：Capan-2,Sw1990,CFPAC-1,Aspc-1,Panc-1)及正常胰腺导管上皮细胞(H6C7)均购自ATCC(美国模式培养物集存库American type culture collection)以及上海细胞库,添加各自适宜的培养基放置于37℃,5%CO2及适宜湿度的无菌专用细胞培养箱中培养。取生长状态良好无污染的对数生长期细胞,采用Trizol(Life Technologies公司)提取细胞总RNA。利用提取的纯度较好的RNA为模板通过逆转录获得cDNA,逆转录的条件为：30℃10min,55℃30min,99℃5min,5℃5min,总共一个循环。随后进行荧光定量PCR,每份标本至少同时做3个复孔,以GAPDH为内参,在ABI-7500型荧光定量PCR仪上进行PCR反应。反应条件为95℃10min-(95℃30s-58℃30s-72℃30s)×50个循环。反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线,利用实时荧光PCR仪自带软件进行分析,获得产物CT值；并回收产物,进行琼脂糖凝胶电泳。产物mRNA的相对表达量采用公式2-ΔCT计算。(CT值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。)ACT即目的基因CT值的平均值减去内参GAPDH CT值的平均值。行qRT-PCR检测胰腺癌细胞(KRAS野生型：Bxpc-3;KRAS突变型：Capan-2,Sw1990,CFPAC-1,Aspc-1,Panc-1)及正常胰腺导管上皮细胞(H6C7)中16种RAS-GAP(RASAL1, RASAL2, RASAL3, RASA1, RASA2, RASA3, RASA4,IQGAP1, IQGAP2, IQGAP3, DAB2IP,SYNGAP1, GAPVD1, ARHGAP5, G3BP1, NF1)的表达情况。根据做出来的胰腺癌RAS-GAP表达谱以及以往文献中报道的DAB2IP具有GAP活性的检测结果,选择在KRAS野生型细胞和突变型胰腺癌细胞中表达有差异(WT<MUT)且有GAP活性的DAB2IP做后续研究。2.采用RIPA法提取胰腺癌细胞(KRAS野生型：Bxpc-3、KRAS突变型：Capan-2,Sw1990,CFPAC-1,Aspc-1,Panc-1)及正常胰腺导管上皮细胞(H6C7)、胰腺癌组织以及癌旁组织的蛋白,BCA法测定蛋白浓度。取10μL蛋白质样品进行10%SDS-PAGE电泳分离蛋白,60V恒压电泳30分钟,待蛋白进入分离胶后再120V恒压电泳90分钟,再以湿转恒流300mA将蛋白转移至PVDF膜上,脱脂奶粉封闭1h,加入一抗Abcam公司的兔抗人DAB2IP多克隆抗体1：2000稀释、兔抗人GAPDH单克隆抗体(CST公司)1：7500稀释,4℃孵育过夜,反复洗膜。随后PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(CST公司)1：2000稀释室温孵育1h,反复洗膜,加入ECL显色液,进行曝光,最后对胶片扫描进行灰度分析。采取上述Western-blotting方法检测胰腺癌细胞(KRAS野生型：Bxpc-3、KRAS突变型：Capan-2,Sw1990,CFPAC-1,Aspc-1,Panc-1)及正常胰腺导管上皮细胞(H6C7)、胰腺癌组织以及癌旁组织中DAB2IP的蛋白表达水平。3.收集广东省人民医院20例胰腺癌患者行根治手术后切除并经病理组织学确诊为原发性胰腺癌,并具有完整病理资料的癌组织标本制成的石蜡切片。所有患者术前均未接受放疗、化疗及免疫、生物治疗。另取相对应的癌旁组织(距离癌组织大于5cm以外的癌旁组织)石蜡切片及按同样方法制成的正常胰腺组织石蜡切片2例(广东省人民医院病理教研室提供)作为对照。提取基因组DNA, PCR扩增KRAS常见突变位点(KRAS12、13、61密码子位点),采用ABI公司生产的3100基因分析仪进行直接测序,检测每例胰腺癌组织的KRAS类型；4.采取免疫组化二步法的方法对DAB2IP在上述胰腺癌组织及癌旁组织、正常胰腺组织中的表达进行检测,并观察其表达水平与胰腺癌患者各临床及病理参数之间的关系。石蜡切片组织常规二甲苯脱蜡,梯度浓度酒精水化；新鲜配制的柠檬酸钠溶液(PH=6.0)高温高压蒸汽3分钟抗原修复,3%过氧化氢室温避光封闭10分钟；PBS泡洗3次,5分钟／次,10%羊血清室温封闭10分钟,然后滴加一抗(Abcam公司,兔抗人多克隆抗体)DAB2IP (1:200),4℃孵育过夜；次日在室温下复温至少半小时后,PBS泡洗3次,5分钟／次；二抗(HRP标记的兔鼠通用抗体,来源于上海基因科技公司的GTVision免疫组化试剂盒)室温孵育30分钟,PBS泡洗3次,5分钟／次；DAB显色,苏木精复染,经返蓝、脱水、透明及封片后在光学显微镜下观察和分析。每次实验均采用PBS液代替一抗作阴性对照,用已知阳性的乳腺癌标本作为阳性对照。阳性判断标准：以胰腺癌细胞质内出现棕黄色至深棕色颗粒为阳性细胞。阳性细胞必须符合以下标准：①细胞结构清晰；②阳性颗粒定位准确；③着色明显高于背景,对比清楚。A：按显色细胞数记分,阳性细胞数<1/3为1分,阳性细胞数1/3-2/3为2分,阳性细胞数>2/3为3分。B：按细胞显色深浅记分,无阳性反应细胞为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。积分数=AxB。AxB=0判断为(-),A×B=1-2判断为(+),AxB=3-4判断为(++),AxB=6-9判断为(+++)。至少随机观察5—10个高倍镜视野(放大倍数为x400)。5.构建特异性DAB2IP siRNA,筛选有效序列。严格按照说明书步骤将DAB2IP siRNA导入KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3,进行实时定量PCR检测导入DAB2IP siRNA后细胞中DAB2IP的RNA表达水平变化,以验证转染效果。6.采取western blotting方法、Ras活性检测及CCK-8(cell counting kit)方法对DAB2IP siRNA导入后DAB2IP蛋白表达水平、相关信号通路下游蛋白(AKT、P-AKT、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK)表达水平、RAS活性水平以及细胞增殖水平的变化进行评估,进而分析评价DAB2IP在KRAS野生型胰腺癌的发生发展中可能起的作用。Ras活性水平采用Millopore公司生产的RAS活性检测试剂盒进行所需蛋白的提取,随后进行western blot检测蛋白表达。CCK-8实验采用株式会社的CCK-8试剂盒进行检测。将常规培养的细胞株制成细胞悬液,加入96孔培养板中,调整细胞密度约为10^4个/孔,37℃5%C02细胞培养箱中培养24h,按照前述方法导入DAB2IP siRNA,每组24孔；并同时设立阴性对照孔和空白对照孔、调零孔,37℃5%C02细胞培养箱中培养48h；每孔加入10μL CCK-8试剂；37℃5%C02细胞培养箱中培养,用酶标仪分别测定加入CCK-8后30min、1h、2h、3h、4h450nmOD值,以时间为横轴,吸光度为纵轴绘制生长曲线。7.采用SPSS13.0软件对实验数据进行统计分析。对正态分布的连续性变量采用(x±s)描述,非正态分布的连续性数据采用中位数(四分位数间距)描述。采用One-way ANOVA分析比较各种胰腺癌细胞株及正常胰腺细胞株中DAB2IP mRNA表达水平及蛋白表达水平差异,采用SNK法比较组间差异；采用两独立样本t检验分析比较胰腺癌组织和癌旁组织中DAB2IP蛋白表达水平差异；DAB2IP蛋白在胰腺癌组织石蜡切片和癌旁组织石蜡切片中的表达情况采取两相关样本的Wilcoxon秩和检验(等级资料),DAB2IP蛋白表达与胰腺癌患者临床参数之间的相关性采取两独立样本的Wilcoxon秩和检验(等级资料)。采用One-way ANOVA分析分别比较3个siRNA序列导入后对KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3的DAB2IP mRNA表达水平之间的差异；采用One-way ANOVA分析分别比较KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3DAB2IP siRNA50nm组、DAB2IP siRNA75nm组、DAB2IP siRNA100m组与阴性对照组的DAB2IP mRNA表达水平之间的差异；采用One-way ANOVA分析分别比较KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3DAB2IP siRNA24小时组、DAB2IP siRNA48小时组、DAB2IP siRNA72小时组与阴性对照组的DAB2IP mRNA表达水平之间的差异；采用One-way ANOVA分析分别比较KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3导入DAB2IP siRNA48小时后DAB2IP siRNA处理组、阴性对照组及空白对照组的DAB2IP蛋白表达水平、相关信号通路下游蛋白(AKT、P-AKT、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK)表达水平、RAS活性水平以及细胞增殖水平之间的差异,采用SNK法比较组间差异。不满足正态分布的的数据采用两样本比较秩和检验(Wilcoxon两样本比较法)。P<0.05表示有统计学意义。结果1.DAB2IP在胰腺癌细胞中的表达各胰腺癌细胞株中DAB2IP的mRNA和蛋白表达水平均低于正常胰腺导管上皮细胞(P<0.05)。KRAS野生型胰腺癌细胞中DAB2IP mRNA和蛋白表达水平低于KRAS突变型胰腺癌细胞。(P<0.05)。5种突变型胰腺癌细胞中DAB2IP mRNA和蛋白表达水平的差异两两相比较无统计学意义(P>0.05)。2.DAB2IP在胰腺癌组织中的表达在所检测的KRAS12、13、61密码子位点上,20例胰腺癌患者中有15例患者KRAS基因存在突变,KRAS野生型5例,突变率为75%。15例KRAS突变中包括13例12密码子突变(86.7%),其中8例GGT突变为GAT (G-D),5例突变为GTT(G-V);2例61密码子突变(13.3%),CAA突变为CTA(Q-L)。13密码子未见突变。免疫组化结果显示：DAB2IP在胰腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织(Z=-4.000,P=0.000)。DAB2IP在KRAS野生型胰腺癌组织中的表达低于突变型胰腺癌组织(WilcoxonW=35.000, P=0.042),有神经束膜浸润的患者DAB2IP表达水平低于无神经束膜浸润的患者(WilcoxonW=71.500, P=0.028)。DAB2IP的表达随着临床分期的升级呈现显著降低,(WilcoxonW=54.000, P=0.002)。DAB2IP的表达水平与患者的性别、年龄、肿瘤最大直径、浸润深度以及淋巴结转移均无关(P>0.05)。3.导入DAB2IP siRNA后KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3中DAB2IP蛋白表达水平及RNA表达水平、相关信号通路下游蛋白表达水平、RAS活性水平以及细胞增殖水平的变化导入DAB2IP siRNA能降低KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3中DAB2IP的RNA及蛋白表达水平,并能使P-AKT及P-ERK蛋白的表达水平升高,P-JNK的蛋白表达水平下降,RAS活性升高(P<0.05)。导入DAB2IP siRNA可以促进KRAS野生型胰腺癌细胞Bxpc-3的增殖生长(P<0.05)。结论DAB2IP在胰腺癌中表达下降,DAB2IP的表达水平与胰腺癌患者的KRAS类型、肿瘤分期以及是否发生神经束膜浸润有关。选择性抑制DAB2IP可以导致KRAS野生型Bxpc-3中的RAS信号通路持续活化,从而促进胰腺癌细胞的增殖和生长。]DAB2IP作为抑癌基因可能通过抑制RAS的活性,并抑制PI3K/AKT信号通路及MAPK/ERK信号通路、激活ASK1/JNK信号通路在KRAS野生型胰腺癌的发生发展中起着重要的作用。