论文部分内容阅读
第一部分表达Livin的逆转录病毒载体的构建、病毒包装和产生目的：为了观察大鼠心肌livin基因的过表达对大鼠心肌细胞缺血再灌注后心肌细胞凋亡的影响，构建表达Livin的逆转录病毒载体，包装产生逆转录病毒颗粒。方法：（1）从鼠乳腺癌细胞MA782中提取RNA，RT-PCR扩增得到Livin cDNA．先克隆入T载体（pGEM-T），经XhoⅠ/HindⅢ双酶切和PCR扩增鉴定，得到重组子pGEM-T-Livin,进行DNA序列测定。XhoⅠ／HindⅢ双酶切下livin目的基因片段，重组入（插入）逆转录病毒载体pLNCX2，XhoⅠ／HindⅢ双酶切和PCR扩增鉴定得到重组子pLNCX2-Livin，将pLNCX2-Livin转染入PT67细胞中进行病毒包装，纯化得到表达Livin的逆转录病毒颗粒。结果：RT-PCR扩增得到816bp的Livin cDNA目的基因片段：筛选得到重组子pGEM-T-Livin，DNA序列分析证实插入序列与GenBank中XM-914797 Livin基因序列完全一致；筛选得到重组子pLNCX2-Livin；包装得到表达Livin的逆转录病毒颗粒，滴度为3．9×107IU／ml。结论：成功构建出表达Livin的逆转录病毒表达载体pLNCX2-Livin，并包装纯化得到逆转录病毒颗粒，为下游实验奠定实验基础。第二部分Livin对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响目的：近年来研究发现凋亡参与了心肌缺血再灌注损伤的发生和发展，天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）被认为是凋亡发生的关键酶和标志酶，Livin是近年来发现的凋亡抑制蛋白家族中的新成员，能够通过抑制Caspase-3而发挥抑制凋亡作用，但是正常心肌细胞内Livin表达较少。为此，本实验拟转染表达livin的逆转录病毒载体，并建立大鼠心肌缺血再灌注模型，观察大鼠心肌缺血再灌注过程中Livin、Caspase-3的表达变化和二者的相关性，以及Livin对心肌梗死范围和心肌细胞凋亡的影响。方法：健康SD大鼠90只，随机分为缺血再灌注组（IR组）、Livin组和假手术对照组（Control组）。缺血再灌注组结扎LAD缺血30min，再灌注120 min；Livin组为缺血再灌注前24h心肌内注射携带Livin的逆转录病毒载体；对照组只穿线而不结扎LAD。再灌注120 min后TTC染色测定梗死范围，硫磺素染色法测定无复流面积，SP免疫组化测定Caspase-3、Livin蛋白表达量，TUNEL法测定凋亡心肌细胞。结果：1．免疫组化法检测心肌细胞有Livin的表达，缺血再灌注增加Livin的表达量（3．10±0．52），但与Control组（2．35±0．47）比较无统计学差异。2．缺血再灌注过程中Caspase-3表达增多明显，IR组（103．39±8．24）较Control组（91．39±4．82）显著增加；注射Livin后则Caspase-3的表达减少，Livin组（97．43±11．15）与IR组比较差异显著。3．Livin组心肌梗死范围（12．80±1．19％）较IR组（20．82±2．82％）显著减少。4．Livin组无复流面积（19．39±6．25％）较IR组（25．93±6．45％）显著缩小；5．TUNEL法检测显示缺血再灌注过程中可见心肌细胞凋亡的发生，IR组（10．35±3．34）较Control组（1．10±0．42）显著增加；注射Livin后则细胞凋亡的发生明显减少，Livin组（1．70±1．57）与IR组比较差异显著，与Control组比较无显著差异。结论：1．正常大鼠心肌细胞有Livin的表达。2．Livin可以抑制缺血再灌注心肌细胞Caspase-3的表达。3．Livin可以减少缺血再灌注心肌梗死范围和无复流面积。4．Livin可以抑制缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生。第三部分荧光定量PCR检测鼠心肌caspase-3，Livin mRNA目的：观察大鼠心肌livin mRNA表达水平以及转染表达Livin的逆转录病毒载体后Livin在心肌表达的变化情况、缺血再灌注过程中Livin，Caspase-3的mRNA表达水平，以及Livin对Caspase-3 mRNA表达水平的影响．方法：提取第二部分实验各组组织总RNA，逆转录为cDNA，用荧光定量PCR方法扩增检测Livin和Caspase-3 mRNA表达水平。结果：荧光定量PCR检测到大鼠心肌细胞有Livin表达，正常组Livin mRNA表达水平（8．41±1．39）×10-3，空载体组为（7．45±2．51）×10-3，IR组为（7．82±3．22）×10-3；Livin组为（145±89）×10-3)，显著高于其他三组（P<0．01）。正常组Caspase-3mRNA相对表达量（5．12±2．11）×10-3；空载体组为（6．88±2．31）×10-3；缺血再灌注过程中Caspase-3表达明显增加(（92．1±34．6）×10-3，显著高于正常对照组和空载体组（P<0．01），说明IR可造成Caspase-3升高；Livin组Caspase-3 mRNA表达水平为（56．2±21．1）×10-3，与IR组相比，显著降低（P<0．05）。说明Livin过表达可有效降低IR组细胞Caspase-3表达。结论：1．正常大鼠心肌细胞有Livin mRNA的表达；2．表达Livin的逆转录病毒载体可以成功转染大鼠心肌；3．转染Livin可以降低大鼠缺血再灌注心肌细胞Caspase-3 mRNA的表达水平，有助于IR中的抗凋亡。