牛乳是婴幼儿最佳的食物蛋白来源,然而,牛乳过敏严重影响了过敏人群的食用安全。牛乳中含有30多种蛋白质,都具有潜在的致敏性,其中酪蛋白、β-乳球蛋白（BLG）和α-乳白蛋白被认为是主要的过敏原。有研究发现大约82%的牛乳过敏患者对BLG过敏。本研究以牛乳中主要过敏原BLG为研究对象,体外模拟胃肠道消化牛乳蛋白,将获得的消化产物的氨基酸序列与牛乳BLG的氨基酸序列比对,并结合T细胞表位预测软件,最终筛选出5条肽段作为T细胞表位,在此基础上评估5条消化肽段对小鼠肠道免疫细胞及CD4⁺T细胞增殖分化的影响,通过这些体外细胞实验验证前期筛选T细胞表位准确性,并探索肠道免疫细胞在BLG致敏过程中变化规律。本研究的主要方法、结果及结论如下。1.运用NetMHC（Ⅱ）/pan、SYFPEITHI、IEDB在线网站对BLG的Th表位进行预测,综合多参数的结果,获得牛乳BLG可能的T细胞表位区分别为AA_1-16,AA_16-31,AA_27-45,AA_68-83,AA_133-154和AA_144-160。同时,通过体外模拟成年人和婴幼儿胃肠道分别消化全牛乳和婴幼儿配方奶粉,Tricine-SDS-PAGE电泳图显示BLG和α-乳白蛋白在模拟婴幼儿消化中更耐消化;进一步液相-质谱技术分析10kDa以下的消化产物,通过质谱对肽段的识别、分类,共检测到730条消化肽段。其中属于BLG的消化肽段共计有109条（Score range>20）,分子量分布在813.42Da-2218.22 Da。BLG的消化肽段集中的区域是AA_1-21,AA_23-61,AA_71-103,AA_107-119,AA_123-140和AA_148-160。结合BLG的消化肽段和Th表位的预测结果,最终合成了5条待验证的T细胞免疫表位区:f1(AA_1-14),f2(AA_24-35),f3(AA_40-60),f4(AA_82-101),f5(AA_123-139)。2.为获得特异性免疫细胞,构建了BLG致敏的小鼠模型。Balb/c小鼠随机分为对照组（C组）、低剂量激发组（M组）和高剂量激发组（F组）,通过三次灌胃和激发完成小鼠致敏,间接ELISA测定小鼠血清中IgE、IgG和IgA的含量,结果显示C、M和F组的BLG特异性IgG抗体未见显著差异（p>0.05）,F组的BLG特异性IgE抗体水平显著高于C组和M组,IgA抗体水平在三个组中均有显著差异（p<0.05）。3.获得小鼠肠LP细胞,运用流式细胞术检测小肠LP细胞中树突状细胞（LPDC）的表型,结果显示M组和F组中CD11c⁺MHCⅡ⁺细胞的比例占80%以上,说明致敏条件下固有层（LP）细胞中DC细胞占主导。其次,CD103⁺CD11c⁺细胞在C组、M组和F组肠固有层细胞中比例分别为46.25±1.63,58.95±4.45和74.00±3.68。4.将消化肽段与LP细胞共孵育,运用流式细胞术测定LPDC细胞表面分子MHCⅡ、CD80和CD86的表达,结果显示不论是低剂量激发还是高剂量激发,肽段f1-f6对CD80和CD86表达水平的影响都是一致的,肽段f3能显著刺激LPDCs成熟,肽段f1和f4能抑制LPDCs的成熟。5.将肽段与肠系膜淋巴结（MLN）细胞共孵育,运用流式细胞术测定MLN中T细胞分化的情况。结果显示,肽段对CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞亚群的影响不显著。在对Th亚群的分化情况中,在C组中,消化肽段均下调了Th1和Th2的表达量。在M组和F组中,肽段f1、f4、f5可以上调Th1细胞的表达,其中肽段f1和f4也能增加Th2细胞的表达。6.获取原代未致敏小鼠脾脏细胞,运用CD4阳性分选磁珠分选CD4⁺T细胞,经流式鉴定CD4⁺细胞纯度达到96.9%,可以用于后续T细胞增殖试验的研究;在此基础上通过CFSE染料染色CD4⁺T细胞,再将其与不同消化肽段、LPDC细胞共孵育刺激72h后,测定T细胞增殖比例、LPDC细胞表面分子表达和细胞上清液中细胞因子的含量。结果显示所有f1-f5肽段都能刺激T细胞增殖;在消化肽段的作用下,MHCⅡ、CD80、CD86和CD209的表达水平维持与无肽段处理相同或者降低,说明肽段f1-f5在此共刺激试验中都不能促进LPDC细胞的进一步成熟。另外5条肽段对T细胞分化影响不明显,其中肽段f1抑制Th1和Th2细胞的分化,促进了Treg细胞分化。