前言 生殖道衣原体(Chlamydial Trachomatis，CT)感染是全球范围内危害妇女生殖健康的主要性传播疾病之一。美国每年有400万新病例，有5万妇女因衣原体感染而不孕。近年我国衣原体生殖道感染发病率逐年增加，20-30％的性传播疾病由衣原体引起，主要表现为宫颈炎，继而发生慢性盆腔炎、异位妊娠和管性不孕等。其感染特征是较隐匿，易迁延，常常造成病原菌的广泛传播，给妇女健康带来很大的危害。但其发病机制尚不清楚，多数研究者认为免疫反应在慢性损伤后遗症的发生中起很大作用，其中沙眼衣原体热休克蛋白60(Chlamydial Heat Shock Protein60，CHSP60)在免疫致病中起关键作用。 CHSP60是衣原体原体(Elementary Bodies，EB)外膜的组成成分之一，参与外膜的再装配过程，可能在衣原体感染的保护性和病理性损伤中起重要作用。早在九十年代初就有动物实验证明TritonX-100可溶性的衣原体EB能够引起动物眼部的超敏反应性炎症，主要为60KD的蛋白质。Bavoil等进一步证明上述蛋白质属于热休克蛋白家族。国外文献报导，将CHSP60接种于已预先感染衣原体的猴输卵管，可引起迟发性变态反应。有报道CHSP60阳性抗体反应与不孕症、异位妊娠的发生有关，这种血清学的相关性提示CHSP60可能是慢性炎症和免疫病理发生的主要原因。既往国外实验研究表明再感染或持续感染和宿主免疫反应是衣原体引起机体免疫致病的重要因素，CHSP60抗体反应是持续或重复衣原体感染的标志。宫颈反复衣原体感染是盆腔炎(Pelvic Inflammatory Disease，PID)发生的危险因素之一，T细胞反应和CHSP60抗体反应可能介导了衣原体感染PID的病理损伤。由于热休克蛋白高度保守，CHSP60和人HSP60有48％同源，CHSP60的抗体反应即为CHSP60和人HSP60共同表位的交叉反应，从而引起自身kD免疫性疾病。动物实验表明纯化的CHSP60是引发迟发性变态反应的致病原。还有一些研究表明，高水平的CHSP60抗体反应与生殖道感染后遗症的发生有关。最近研究认为CHSP60引起的抗体反应增强使PID的危险性增加了2-3倍，是CT免疫致病的主要因素。如果能克隆 CHSP60基因并纯化CHSP60，对研究其在生殖道感染免疫致病中的作用具 有重要意义，目前国内尚无这方面的研究报道。 CHSP60抗体产生的原因可能与持续感染重复刺激B细胞或遗传因素 有关。小鼠实验证明CHSP60抗体反应是受组织相容复合体所限制，其基 因位于＊基因附近，人类同源基因是HLA－Do a或p基因。国外研究发 现沙眼衣原体感染人群具有一种或几种衣原体抗原的HLA遗传限制性表 位，HLA－A6802与沙眼发病有关，提示HLA－A6802可能限制细胞毒T细 胞的免疫致病作用，是发病的易感基因。CT引起PID的免疫反应是否也受 遗传调控，该病的易感性是否带有遗传因素，是否存在先天的疾病易感基因 或免疫应答方面的异常。疾病易感和免疫反应遗传调控是目前研究的热 点，目前尚无研究报道。由于近年我国性病感染率呈明显上升趋势人T作 为PID的主要致病因子之一也越来越受到关注。本文通过基因工程的方法 对CHSP60抗原基因进行克隆和分高纯化，同时应用纯化的重组CHSP60 融合蛋白，建立 ELISA方法检测盆腔炎病人血清 CHSP60抗体，来探讨 CHSP60与 CT感染后遗症发生机制的关系。通过研究检测 HLA－DQ等位 基因与CHSP60抗体反应的关系，了解CHSP60抗体反应是否受遗传调控， 通过研究 HLA－DQ等位基因与 CT慢性感染疾病的相关性，寻找与疾病相 关的易感基因。 材料和方法 1．提取衣原体DNA：按深圳匹基公司试剂盒说明进行。 2．PCR扩增建立重组质粒：PCR扩增上、下游引物中引人限制内切 BamH和EcoR酶酶切位点，便于下一步与 GST融合蛋白表达载体连接。 上游引物：5’CCGGATCCATGGTCGCTAAAAACAMA 3’ BamH 下游引物：5’TCCGAATCC’ITACTAATAAGTCCAnCCTGCGCCAG 3’ Ec。RI PCR反应体系如下：总体积100…，反应条件为94T预变性smin；然后 按94℃ lmin，56℃ lmin，72t．smin，循环30次；72℃延伸 10min＊ 3．GST融合系统的构建及验证：以 BamH和 EcoR酶切割 PCR产 物（ST帅GEX－ZT）质粒，双酶切割产物纯化后，在T4 DNA连接酶作用下 ·2·与GST融合表达载体连接。含C HSP60基因GST融合表达载体转化到E．COlt菌株中，经蓝白筛选获得阳性菌落。 4．融合蛋白的表达和纯化：融合蛋白经IPfG诱导，进行超声破碎，以SDS－PAGE凝胶电泳分析，亲和层析纯化融合蛋白参照GST系统说明书进行。 5．纯化蛋白表达水平的检测：通过GST活性检测＊DNB）来反应融合蛋白表达的相对水平。用U－200 sPectrOPhotomder（日立公司生产）进行蛋白浓度的测定。 6．血清学研究对象：按欧盟组织诊断标准选择盆腔炎患者 102例，还需满足以下条件：既往有衣原体生殖道感染史；性伴有衣原体感染史；宫?