目的:构建表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)组织蛋白酶B(Cathepsin B,CB/ Sj31)基因的原核表达系统,优化表达条件,以期获得重组组织蛋白酶B的高效表达,为进一步研究组织蛋白酶B的生化特性和生物学功能奠定基础。方法:1.基因克隆:提取日本血吸虫总RNA。Genebank中获得Sj31基因全长,通过RT-PCR扩增Sj31基因的cDNA序列(含768个碱基),基因克隆技术构建pET30a- Sj31重组表达载体。采用氯化钙共沉淀法将重组子转化至E.coli DH5α和BL21(DE3)。PCR、酶切、测序方法筛选阳性重组子。2.蛋白表达:①抗血清的制备:取感染日本血吸虫的大白兔心脏血,分离取血清。经大肠杆菌裂解液吸附法处理。②IPTG诱导BL21(DE3)细菌重组Sj31蛋白表达,经SDS-PAGE电泳及用5×His单抗(小鼠源)抗原鉴定融合蛋白。用兔抗日本血吸虫多克隆抗体,检测蛋白的抗原性。优化诱导表达的时间和IPTG的诱导浓度,诱导重组蛋白大量表达。结果:1.提取了日本血吸虫成虫的总RNA。两步法RT-PCR扩增出Sj31基因的cDNA序列。基因克隆技术成功构建pET30a- Sj31重组表达载体。2.重组子可被IPTG诱导表达,诱导表达的重组蛋白可被5×His单抗(小鼠源)抗原识别;并且重组蛋白可被兔抗日本血吸虫多克隆抗体识别。当诱导表达时间为4h、IPTG终浓度为1.0mmol/L时,表达量最大。结论:成功构建Sj31基因的原核表达系统,获得高效表达;重组蛋白肽段具有良好的抗原性。为进一步研究其功能打下了必要的基础。