弓形虫是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫,是非常重要的人兽共患病原体,感染全球三分之一以上的人口和难以计数的野生动物与家畜,造成严重的社会问题和巨大的经济损失。弓形虫生活史复杂,在中间宿主体内有速殖子和缓殖子两种形式,对应急性和慢性感染,这二者之间能够相互转化且这种转化是弓形虫传播和致病的关键因素。阐明速殖子和缓殖子时期虫体的生长代谢规律对理解其生活史和设计药物与疫苗非常重要。速殖子和缓殖子存在明显的代谢活动差异,绝大多数糖酵解酶在虫体中有两个亚型,且每一对中两个亚型的表达在速殖子与缓殖子期呈显著差异。此外,当前的模型认为,弓形虫速殖子有很好的代谢灵活性,葡萄糖作为碳源的代谢可以被谷氨酰胺取代而不明显影响虫体生长。那么糖酵解在虫体生长发育中到底有什么作用?带着这个问题,本研究选取糖酵解中的乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸激酶（PYK）为研究对象,采用遗传学、代谢组学和生物化学等方法研究它们在虫体生长发育中的生物学作用,具体包括:（1）乳酸发酵对体内弓形虫生长的关键作用及机制弓形虫表达两个乳酸脱氢酶,我们对速殖子期特异性表达的LDH1和缓殖子期特异性表达的LDH2进行单独或者联合敲除,结果表明:LDH1和LDH2均对弓形虫体外正常条件下的生长不重要,然而含有Δldh1的突变体无法在体内繁殖,进而降低其毒力和包囊的形成。LDH2的缺失导致虫体毒力轻微下降但不影响包囊的形成,也不影响虫体在体内外的生长,说明LDH2在虫体内的作用有限。进一步分析发现:Δldh1Δldh2虫株在3%O₂条件下复制显著减慢,并对TCA循环抑制剂Oligomycin A高度敏感,综上表明:当氧气有限、氧化磷酸化提供的能量不足时,LDH1介导的乳酸发酵成为关键的能量补充,对生理条件下弓形虫的生长极为关键。（2）乳酸脱氢酶缺失虫株可作为减毒活疫苗提供良好的免疫保护弓形虫乳酸脱氢酶敲除虫株（ME49Δldh）体外生长正常但不能在体内繁殖,使之成为良好的候选减毒活疫苗。本研究评估了ME49Δldh的免疫保护性,小鼠免疫ME49Δldh虫体30 d后,可以有效地抵抗野生型虫株RH、ME49、VEG及本地分离株中国1号的再感染,也不产生新的脑包囊,保护力近100%。免疫ME49Δldh虫体125 d后,仍可以对ME49和VEG野生型虫株感染产生100%的免疫保护。进一步研究发现,免疫接种ME49Δldh虫株后,由体液免疫产生的弓形虫特异性IgG一直维持在较高水平（≥125 d）,然而使用来自免疫小鼠的血清进行被动免疫实验,结果显示:尽管免疫血清可以降低野生虫株在体内的繁殖,但整体保护力有限。另一方面,在免疫接种ME49Δldh早期,宿主可以产生高水平的细胞因子INF-γ和IL-12。分离免疫接种ME49Δldh虫株160 d后小鼠的脾细胞进行全虫抗原刺激,可以产生高水平的细胞因子INF-γ和TNF-α,而INF-γ是宿主控制弓形虫感染重要的细胞因子之一。综上表明:ME49Δldh诱导的免疫保护中,细胞免疫很可能起主导作用,而体液免疫贡献有限。（3）丙酮酸稳态对弓形虫代谢灵活性及生长非常关键先前关于葡萄糖转运蛋白（GT1）和己糖激酶（HK）的研究发现,敲除GT1或HK对弓形虫体外生长影响不大,故而认为:当弓形虫能够利用谷氨酰胺时,葡萄糖代谢的糖酵解途径不重要,我们对LDH的研究结果表明,乳酸发酵对生理条件下弓形虫的生长及供能极为关键。敲除GT1或HK与敲除LDH表型的差异,促使我们重新探究糖酵解途径在虫体适应不同生长条件下的作用,为此,我们聚焦糖酵解中的丙酮酸激酶（PYK）进行进一步研究,虫体表达两个PYK,定位于胞质的PYK1和顶质体定位的PYK2。研究结果表明:PYK1抑制导致碳代谢紊乱,降低ATP水平,积累大量支链淀粉,造成严重的生长缺陷,这些生长缺陷能够通过外源添加乳酸和丙氨酸进行拯救。单独敲除PYK2对虫体生长影响不大,但同时缺失PYK1和PYK2导致弓形虫顶质体丢失和虫体死亡。此外,本研究发现,弓形虫除了能够利用葡萄糖和谷氨酰胺,也能够利用乳酸和丙氨酸作为碳源,具有代谢灵活性,所有的这些碳源均需转化为丙酮酸,丙酮酸处于弓形虫碳代谢的中心。这些结果表明,糖酵解途径中至少生成丙酮酸这一步对虫体非常关键。综上所述,本研究通过对LDH的研究,发现其介导的乳酸发酵对生理条件下弓形虫的生长极为关键,其敲除虫株（ME49Δldh）是一株免疫保护效果良好的候选减毒活疫苗。通过对PYK的研究,发现维持丙酮酸稳态对弓形虫碳代谢平衡及生长非常关键。这些结果为理解弓形虫寄生生活的分子机制和研发新型防控技术提供了新的基础。