【摘 要】
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阪崎克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉(powdered infant formula,PIF)中常见的食源性致病菌,鉴于阪崎克罗诺杆菌较其他肠杆菌具有较强的环境耐受性,能够长期生存于PIF中,且对新生儿也有潜在的危害,所以对阪崎克罗诺在环境耐受机制方面的研究很有意义,有利于阪崎克罗诺杆菌的预防工作。γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)是一类广泛存在于生物体内的非蛋白四
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阪崎克罗诺杆菌是婴幼儿配方奶粉(powdered infant formula,PIF)中常见的食源性致病菌,鉴于阪崎克罗诺杆菌较其他肠杆菌具有较强的环境耐受性,能够长期生存于PIF中,且对新生儿也有潜在的危害,所以对阪崎克罗诺在环境耐受机制方面的研究很有意义,有利于阪崎克罗诺杆菌的预防工作。γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid,GABA)是一类广泛存在于生物体内的非蛋白四碳氨基酸,由gabT调节的γ-氨基丁酸转氨酶是GABA代谢旁路的重要蛋白质。本研究通过建立阪崎克罗诺杆菌的ATCC 29544 gabT基因敲除菌株(ΔgabT),探讨gabT控制的GABA代谢旁路对阪崎克罗诺杆菌抵抗干燥、酸、渗透压环境胁迫的作用,同时结合转录组学技术从分子层面揭示了阪崎克罗诺杆菌在基于GABA代谢旁路的干燥胁迫应答机制。本研究测定了野生型菌株(WT)和ΔgabT基因敲除株在干燥条件下存活情况。结果表明,ΔgabT在干燥胁迫下处理一周后存活率可达到28.64%,显著高于WT的存活率1.57%。此外,GABA在ΔgabT中累积量高于WT,与存活率结果具有一致性,表明GABA累积能帮助阪崎克罗诺杆菌抵御干燥胁迫。扫描电子显微镜检测结果也显示ΔgabT菌株具有较完整的细胞膜形态,进一步验证了GABA积累有助于阪崎克罗诺杆菌在干燥环境胁迫下的生存。以阪崎克罗诺杆菌野生株WT和ΔgabT菌株为研究对象,开展酸、渗透压逆境胁迫下菌体存活率测定、细胞内GABA含量测定实验及生物膜的形成情况测定。发现在酸碱度(Potential of hydrogen,p H)=3.4酸胁迫下6 h后WT的存活率(1.01%)显著低于ΔgabT存活率(28.73%),在9%Na Cl渗透压胁迫下WT存活率(0.26%)也显著低于ΔgabT存活率(16.17%),GABA在ΔgabT中累积量均高于WT,表明GABA累积有助于细菌抵抗酸和渗透压胁迫。此外,轻度的外界胁迫环境使得阪崎克罗诺杆菌生物膜形成能力增加,相比于WT菌株,由于ΔgabT菌株中GABA含量增加使得其具有较强的生物被膜形成能力。结合转录组测序技术,在干燥胁迫下,WT与ΔgabT基因缺失菌株面对干燥胁迫响应存在共性,都会通过累积GABA、甜菜碱、海藻糖等相容性物质来应对干燥胁迫。相比WT菌株,ΔgabT基因缺失菌株通过调节1245个差异基因来抵御干燥胁迫,主要表现为:a)GABA合成相关基因上调,GABA代谢受阻,从而导致GABA累积,减少干燥造成细菌的细胞膜损伤;b)减少了在三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCA)中消耗的能量,糖原倾向于分解代谢,降解为单糖,用于应对干燥胁迫下胞内物质的合成或转运以及弥补胞内干燥环境下高于正常状态下的各反应供能量需求;c)累积的GABA代替了部分海藻糖功能,从而降低海藻糖的合成,保证干燥下相容性物质转运蛋白的活性,降低干燥环境对细胞造成损伤,维持细胞正常代谢;d)通过增加脂多糖合成及胞外转运,降低鞭毛活性,加强自聚集效应,从而提升生物膜形成能力,进一步增强了其对干燥胁迫的抵抗能力。本研究明确了gabT控制的GABA代谢旁路在阪崎克罗诺杆菌耐受逆境胁迫中的重要作用,为阪崎克罗诺杆菌中基于GABA旁路的靶向调控奠定了基础,为阪崎克罗诺杆菌防控提供新思路。
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