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L-谷氨酰胺在生命活动中具有重要作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。随着市场需求的不断增大,提高谷氨酰胺的生产效率显得至关重要,而代谢途径的优化可能对生产效率的提高起到非常重要的作用。本文以L-谷氨酰胺生产菌Corynebacterium glutamicum GM34为出发菌,以提高谷氨酰胺的产量、减少副产物谷氨酸产量和构建温敏型谷氨酰胺生产菌为目标,对C. glutamicum GM34进行了一系列分子改造。主要研究内容和结果如下：(1)NCg11221基因编码的蛋白是重要的谷氨酸分泌载体,为了研究NCg11221基因缺失对副产物谷氨酸积累的影响,采用同源重组技术敲除了谷氨酰胺生产菌GM34的NCg11221基因,构建了菌株GM34△NCgl1221。在5L发酵罐上进行了分批补料发酵实验,结果菌株GM34△NCgl1221的谷氨酸积累量为0.17(g/g DCW),比出发菌降低了19.1%,而谷氨酰胺的积累量未见明显变化。(2)丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,Pc,由pyc基因编码)在谷氨酸棒杆菌的回补途径中有重要作用。利用穿梭质粒pXMJ19构建了pyc基因过表达菌株GM34pXMJ19pyc。5L发酵罐分批补料发酵实验结果表明,过表达pyc基因使菌体生长速度得到了提升,谷氨酰胺产量为3.3(g/gDCW),比对照组提高了5.5%。(3)温度敏感突变株相比现有的生物素缺陷菌株具有非常多的优点。ItsA基因的突变可以使某些谷氨酸棒杆菌菌株转变为温度敏感菌株。利用整合载体pK18mobsacB,通过同源重组技术敲除了谷氨酰胺生产菌GM34的ltsA基因,构建了菌株GM3△ltsA。培养发现GM34△ltsA38℃下仍能生长。在5L发酵罐上进行发酵实验,发现温度转换不能诱导L-谷氨酰胺分泌。说明ltsA基因缺失不能使GM34转变为温度敏感突变株,这为以后的进一步改造提供了一定的借鉴。(4)PH控制对谷氨酰胺发酵有重要影响。发酵20h左右,发酵液中谷氨酸含量不再增加,而谷氨酸是谷氨酰胺的直接前体物,推测此时谷氨酸的生成已经不能满足谷氨酰胺合成的需要。为了加强前体物的合成速度,研究此时分别调整pH提升至5.8、6.0和6.2对谷氨酰胺发酵的影响。发酵结果表明,在pH5.8和6.0时副产物谷氨酸含量不会增加,谷氨酰胺产量分别为54.3g/L和57.2g/L,pH6.2时副产物谷氨酸积累量升至12.4g/L,谷氨酰胺产量为50.6g/L。