论文部分内容阅读
[目的]观察uc40-siRNA-44沉默表达的稳定株对小鼠畸胎瘤细胞(P19细胞)增殖、分化、凋亡和心肌样细胞线粒体功能及在向心肌样细胞分化过程中心肌标志物及关键基因PBX1的变化,探讨uc40与其潜在靶基因PBX1的相互关系。【方法]构建uc40-siRNA-44质粒载体,将其与siNC对照载体分别转染P19细胞,荧光显微镜观察转染效率,并用新霉素筛选5天,克隆化筛选稳定表达的细胞株,应用RT-PCR法验证uc40的沉默表达效果;CCK-8法检测细胞增殖、PI染色法检测细胞周期,Annexin V PE/7-AAD法及Caspase 3活性检测细胞凋亡;1%DMSO诱导培养P19细胞10天使其分化成为心肌样细胞,倒置显微镜下观察各时间点细胞分化形态变化,并对诱导第10天的心肌样细胞,采用PCR法检测细胞线粒体DNA拷贝数、生物发光法检测线粒体ATP产量、DCFDA荧光探针及荧光显微镜检测细胞活性氧(ROS)、JC-1荧光探针及荧光显微镜检测线粒体膜电位(MMP);运用RT-PCR检测细胞分化过程中各时间点关键基因PBX1 mRNA及心肌标志物 GATA4 mRNA、Nkx2.5 mRNA、ANP mRNA 和 cTnl mRNA 的表达变化。采用Western Blot法检测细胞分化各时间节点ANP与cTnl的蛋白表达水平。【结果]成功构建uc40-siRNA-44质粒载体,验证了 uc40沉默效果并筛选获得稳定表达细胞株;uc40-siRNA-44沉默能够明显促进P19细胞的分化,GATA4 mRNA、Nkx2.5 mRNA基因水平的表达上调提示搏动样细胞为心肌样细胞,但胚胎样细胞的形态及出现搏动样心肌细胞的时间在uc40-siRNA-44沉默组和siNC对照组没有显著差异;uc40-siRNA-44沉默能明显促进P19细胞进入细胞周期S期,具有促进P19细胞增殖和抑制P19细胞凋亡的作用;在线粒体功能研究中,uc40-siRNA-44沉默表达的心肌样细胞ATP产量及mtDNA拷贝数在两组间无明显差异,相对于siNC对照组,uc40-siRNA-44沉默组中MMP轻度升高,细胞ROS生成轻度减少;细胞分化过程中,心肌分化相关标志基因PBX1在uc40-siRNA-44组中明显高于对照组,且随着分化时间而呈上升趋势,而心肌标志物ANP与cTnI虽然随着时间的推移而不断上升,但uc40-siRNA-44组的上升趋势明显不如siNC对照组。【结论】uc40-siRNA-44沉默具有促进细胞增殖和分化、抑制细胞凋亡的作用,并在一定程度上可能有利于维持线粒体的正常功能;uc40与靶基因PBXI呈负性相关,其促进心肌样细胞分化可能与uc40-siRNA-44沉默后,解除IncRNA对其靶基因PBX1的抑制,激活其信号通路,从而打破发育平衡,导致细胞无法发育成正常的心肌细胞有关。