论文部分内容阅读
第一部分转录因子RBPJ参与神经母细胞瘤Notch信号通路调控过程目的:探索研究神经母细胞瘤(NB)中参与Notch信号通路过程中的关键转录调控因子,并探索该转录因子在神经母细胞瘤中的调控作用。方法:通过综合分析GEO(GSE62564)数据库,找到参与神经母细胞瘤分期、进展及MYCN扩增的Notch信号通路相关转录因子,综合分析出有意义的转录因子,进一步通过GEO数据库分析该转录因子在神经母细胞瘤中生存意义并分析该转录因子在神经母细胞瘤不同分期、进展及MYCN扩增的NB中的表达水平。进一步通过蛋白免疫印迹(Western-blot),免疫组织化学方法(IHC)检测该转录因子在分化良好的神经母细胞瘤、低分化神经母细胞瘤及未分化神经母细胞瘤组织中表达水平,并探讨其是否具有临床意义,最后通过实时定量PCR、Ch IP等实验方法证实该转录因子对Notch信号通路调节过程中相关基因的转录活性及表达水平的影响。结果:GEO数据库综合分析显示转录因子MAML3与RBPJ是可能参与神经母细胞瘤Notch信号通路过程的关键转录因子。GEO数据库(GSE62564)分析上述两种转录因子在神经母细胞瘤中的生存,我们选择了生存意义较大的RBPJ进行分析,GEO(GSE62564)数据库分析、免疫组化、及Westren-blot检测神经母细胞瘤细胞株和不同分化组织中的结果表示,RBPJ在神经母细胞瘤中呈现出高表达状态。在神经母细胞瘤细胞株中敲低RBPJ可以显著增加Notch信号通路相关基因HES1,HES4,HEY1,HEY2的转录水平(p<0.01),但对OCT4的转录水平无明显影响(p>0.05)。此外,敲低RBPJ能够明显抑制RBPJ与下游启动子区域的结合(p<0.01)。结论:在神经母细胞瘤细胞中,转录因子RBPJ可以通过结合相关Notch信号通路相关基因的转录调控,具体调节基因为HES1,HES4,HEY1和HEY2,同时,RBPJ在神经母细胞瘤中作为一个预后不良因素存在。第二部分SNW1蛋白与转录因子RBPJ在神经母细胞瘤中相互作用目的:探讨在神经母细胞瘤中与转录因子RBPJ相互作用的蛋白,进一步探索RBPJ上游的调控。检测该上游蛋白在神经母细胞瘤中的表达情况,并验证其相互作用。方法:利用IID,Bio GRID和STRING数据库,分析与RBPJ相互作用的蛋白,通过IP和考马斯亮蓝染液方法进一步验证上述数据库所推导蛋白;通过正向和反向Co-IP进一步验证转录因子RBPJ与其相互作用,利用双分子荧光互补实验(Bi FC)验证二者是否直接相互作用。通过GEO(GSE62564)数据库分析互作蛋白生存意义及探究其与神经母细胞瘤分期、进展、MYCN扩增的转录水平,通过免疫组织化学方法(IHC)检测该蛋白在节细胞神经母细胞瘤、分化良好的神经母细胞瘤、低分化神经母细胞瘤及未分化神经母细胞瘤组织中表达水平,探讨其是否具有临床意义;结果:综合多种蛋白互作数据库分析发现转录因子RBPJ可能与7种蛋白相互作用,接下来在神经母细胞瘤细胞株中通过IP和考马斯亮蓝染色进一步验证了RBPJ可能与SNW1相互作用;此外,通过正向和反向Co-IP验证了RBPJ与SNW1相互作用,双分子荧光互补实验(Bi FC)证实了其推导的正确性;通过GEO(GSE62564)数据库分析表明SNW1的生存意义(p<0.01),并与神经母细胞瘤的分期、进展及MYCN的扩增密切相关(p<0.01),临床标本SNW1表达水平在节细胞神经母细胞瘤、分化良好的神经母细胞瘤、低分化神经母细胞瘤及未分化神经母细胞瘤组织中依次升高(p<0.01),数据库分析结果表明,SNW1与RBPJ其转录水平呈正相关性,其中R=0.3975(p<0.01)。结论:这些数据表明SNW1能够与RBPJ相互作用,SNW1在神经母细胞瘤中作为预后不良因素且与RBPJ呈正向相关性。第三部分SNW1抑制Notch信号通路通过与RBPJ相互作用目的:探讨在神经母细胞瘤中SNW1调控Notch信号通路的机制。方法:建立并筛选稳定敲低RBPJ与过表达/敲低SNW1的神经母细胞瘤细胞株,评估过表达/敲低SNW1对神经母细胞瘤细胞株Notch信号通路的调控过程,RBPJ与SNW1进行回补实验,通过Western-blot进行RBPJ与SNW1表达水平的验证,并进一步通过实时定量PCR对Notch信号通路下游靶基因HES1、HES4、HEY1、HEY2和OCT4转录水平的检测,通过回补实验研究SNW1调控Notch信号通路的调控机制。结果:与对照组相比,过表达SNW1能够明显抑制Notch信号通路靶基因HES1,HES4,HEY1,HEY2的转录水平(p<0.01),但是对OCT4的转录水平无明显影响(p>0.05)。相应地,敲低SNW1能够明显促进HES1,HES4,HEY1,HEY2的转录水平(p<0.01),对OCT4的转录水平无明显影响(p>0.05)。回补实验结果表明(p<0.01),在敲低RBPJ的情况下,SNW1不能够对Notch信号通路进行调节。结论:SNW1能够抑制Notch信号通路,是通过与RBPJ相互作用进行调控的。