癫痫(Epilepsy,EP)是一常见的慢性神经系统疾病,癫痫发作时大脑神经元兴奋性增高及异常同步化放电,可导致短暂的中枢神经系统功能失调,临床主要表现为突然出现和反复发作的惊厥行为。癫痫持续发作超过30分钟则将引起脑内神经元的损伤或丧失,发展为癫痫持续状态(Status epilepticus,SE)。癫痫患者或动物模型常伴有认知功能障碍,主要表现为学习记忆能力等的下降。研究发现认知行为与黑质-纹状体和中脑边缘多巴胺能神经体系密切相关。而除了被广泛熟知的谷氨酸和γ氨基丁酸,多巴胺(dopamine,DA)也参与了癫痫的发作和传播,如SE大鼠海马(Hippocampus,Hip)和纹状体DA含量减少,癫痫发作时黑质(Substantia nigra,SN)和纹状体多巴胺转运体(dopamine transporter,DAT)蛋白表达下降等。因此,推测保护DA能神经体系能够改善癫痫发作引起的认知功能障碍。癫痫的发病机制十分复杂,有研究证实氧化应激产生的氧自由基连锁反应是癫痫发作和神经退行性变的核心环节。氧化应激是由于体内氧化和抗氧化作用之间的稳态失衡,导致自由基产生过多和(或)清除能力下降。在中枢神经系统中,自由基主要源于兴奋性氨基酸和神经递质的代谢。癫痫发作时神经元的异常放电和兴奋性毒性作用使脑内活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)产生增多,抗氧化能力减弱,过度堆积的ROS可极大的损伤神经元的结构和功能。同时,氧化应激也是DA能神经元退行性变的机制之一,通过激活SN和腹侧被盖区(ventral tegmental,VTA)的抗氧化体系可改善衰老相关的DA能神经元的功能下降。因此,针对氧化应激在癫痫发作中的参与,提高抗氧化能力可能成为治疗癫痫发作引起的DA能神经体系功能紊乱的一种手段。NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)是细胞调节氧化应激反应中的关键因子,近年研究发现Nrf2以Nrf2-ARE信号通路介导并激活多种Ⅱ相解毒酶和抗氧化基因的转录,从而减轻氧化应激引起的细胞损伤,维持氧化-抗氧化系统在机体内的稳态。生理条件下,nrf2位于细胞质中与keap1结合形成无活性的复合体。氧化应激状态可诱导nrf2与keap1解离而活化,活化的nrf2由细胞质转移到细胞核,与抗氧化反应元件(theantioxidantresponseelement,are)结合,启动are下游的血红素氧合酶1(hemeoxygenase1,ho-1)和依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1(nadph:quinoneoxidoreductase1,nqo1)等抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的转录和表达以增强细胞的抗氧化能力和保护细胞免受毒物损伤。研究已证实激活nrf2-are信号通路可增加总蛋白和细胞核nrf2的表达,该信号通路的中断增加了机体对氧化应激和有毒物质的易感性,而上调神经元ho-1或nqo1的表达可保护它们抵抗氧化应激和兴奋性毒性作用的损伤。近期研究表明莱菔硫烷(sulforaphane,sf)可通过激活nrf2-are信号通路改善慢性杏仁核点燃动物模型癫痫发作引起的氧化应激状态和认知障碍。己酮可可碱(pentoxifylline,ptx)是一种非特异性磷酸酶二酯酶抑制剂(phosphodiesteraseinhibitors,pdei)和弱腺苷受体拮抗剂,可以快速有效的穿过血-脑屏障(blood-brainbarrier,bbb)发挥抗氧化作用和调控脑内的各种神经递质释放。由于ptx的血液流变学作用,最初常用于治疗呼吸系统和外周血管系统疾病。近年有研究发现ptx具有神经保护作用,可以改善中风、脑缺血等引起的神经行为学障碍,提高谷氨酸致海马损伤大鼠的学习记忆能力,预先腹腔给予ptx可减轻se大鼠的发作程度和海马的神经损伤,但其机制尚不清楚。癫痫发作起病突然,需要快速终止痫性发作尤其是se以防止脑内相关神经元的损伤。口服、肌肉注射、静脉点滴等常规给药方式导致药物不能被快速吸收或操作无法立即实施,可能延迟或失去治疗的最佳时机,危及到病人的生命。之前的研究显示通过鼻腔给予中重度青少年和成年癫痫患者咪达唑仑、地西泮和劳拉西泮可以有效终止癫痫发作并避免发作后的行为学改变,是一种安全易行的治疗手段。目前,鼻腔给予ptx对癫痫发作是否有效尚无研究。氯化锂-匹罗卡品(lithium-pilocarpine,li-pc)诱发的大鼠癫痫模型具有与人类颞叶癫痫相似的病理和临床特征,是理想的颞叶癫痫动物模型,适用于筛选抗癫痫药物及探讨癫痫形成机理。因此,本课题以li-pc诱发的癫痫发作大鼠为动物模型,观察鼻腔给予ptx对大鼠癫痫发作和认知行为的影响;检测并分析与认知行为密切相关的中脑腹侧da能神经元的功能;分析并探讨氧化应激各指标及nrf2、ho-1和nqo1在观察脑区的表达改变;检测相关脑区camp的含量变化。期望所获结果为癫痫的发病机制和治疗提供实验依据,同时为ptx治疗癫痫提供新的给药途径。第一部分ptx降低li-pc诱发大鼠癫痫发作并改善其认知功能障碍目的:探讨ptx预处理对li-pc诱发的大鼠癫痫发作和认知行为障碍的影响。方法:以li-pc诱发的癫痫发作大鼠动物模型,鼻腔或腹腔预先给予大鼠ptx;计数癫痫发作率、癫痫发作潜伏期等指标;morris水迷宫实验检测大鼠的认知行为;timm染色显示大鼠海马ca3区苔藓纤维出芽(mossyfibersprouting,mfs);液质联用(hplc-ms)检测大鼠海马da及其代谢产物含量。结果:1一般观察:空白对照组和各药物对照组大鼠无异常反应。se-in组和se-ip组大鼠在匹罗卡品注射6min或5min后逐渐表现为缩瞳、轻微颤抖、竖毛、流涎、血泪、腹泻和刻板运动等外周胆碱能症状。癫痫发作率为100%;癫痫发作潜伏期分别为11.92±3.38min和10.77±3.52min;85.71%(se-in组)和80.95%(se-ip组)的大鼠发展为癫痫持续状态,癫痫持续状态潜伏期分为24.07±2.17min和25.19±4.41min。匹罗卡品注射后24h内死亡率为9.52%。己酮可可碱预处理减少癫痫发作率、减轻癫痫发作的外周胆碱能症状,缩短癫痫发作时间。与相应的癫痫发作组(se-in、se-ip)相比,ptx+se-in组(23.81%)和ptx+se-ip组(38.10%)癫痫发作率明显降低(p<0.01);ptx+se-in组(33.59±6.15)和ptx+se-ip组(28.33±5.50)平均潜伏期明显延长(p<0.01)。ptx+se-in组和ptx+se-ip组均未出现癫痫持续状态(p<0.01),大鼠在匹罗卡品注射后24h内存活率100%。2morris水迷宫鼻腔给药组:morris水迷宫的1-5天各组大鼠寻找平台的逃避潜伏期存在显著统计学差异(p<0.01),各组实验大鼠找到平台的逃避潜伏期逐日递减;与con-in组相比,se-in组大鼠找到平台的逃避潜伏期显著延长(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠找到平台的逃避潜伏期明显缩短(p<0.05),接近正常水平;con-in组、licl-in组和ptx-in组大鼠逃避潜伏期无明显差异。se-in组大鼠穿越平台的次数以及在目标象限停留的时间均显著低于con-in组(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠穿越平台象限的次数以及在目标象限停留的时间均显著增加(p<0.01);con-in组、licl-in组和ptx-in组大鼠在空间探索实验中无明显差异。腹腔给药组:与se-ip组相比,腹腔注射ptx显著缩短了大鼠的逃避潜伏期显著延长(p<0.01);增加了其穿越平台的次数以和在目标象限游泳的时间(p<0.01)。3timm染色鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间ca3区的timm染色评分(kruskal–wallistest,χ2=15.579,p<0.01)存在显著差异。各组间比较表明se-in组大鼠timm染色评分较con-in组显著升高(p<0.01)。ptx+se-in组大鼠timm染色评分较se-in组明显降低(p<0.01)。各对照组间timm染色评分无明显区别。腹腔给药组:与se-ip组相比,腹腔注射ptx也显著改善li-pc诱发大鼠在海马ca3区的的timm染色评分(p<0.01)。4da及其代谢产物鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间hip的da(f(4,22)=61.733,p<0.01)、dapac(dopac:f(4,22)=92.890,p<0.01)和hva(hva:f(4,22)=40.507,p<0.01)含量明显不同。各组间两两比较发现,与con-in组比较,se-in组da及其代谢产物的含量明显下降(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠da、dopac和hva在hip处分别升高了93%、216%和51%(p<0.01)。各对照组之间da、dapac和hva含量无明显区别。腹腔给药组:与se-ip组相比,ptx+se-ip组大鼠da、dopac和hva在hip脑区分别升高了86%、160%和53%(p<0.01)。小结:1li-pc诱发的癫痫发作大鼠伴有认知功能障碍。2ptx预处理降低li-pc诱发大鼠的癫痫发作并改善其认知功能障碍。3ptx预处理减少li-pc诱发癫痫大鼠海马苔藓纤维的发芽、降低da能神经支配的损伤。4鼻腔给药可作为治疗癫痫的一种给药途径。第二部分ptx改善li-pc诱发癫痫大鼠中脑da能神经元的功能活动目的:探讨ptx预处理对li-pc诱发癫痫大鼠中脑腹侧(ventralmidbrain,vm)、尾壳核(caudate-putamen,cpu)和海马(hippcampus,hip)多巴胺能神经活动的影响。方法:利用实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,rt-pcr)检测大鼠vm的thmrna和datmrna含量、免疫印迹技术分析大鼠vm、cpu和hipth和dat的蛋白变化、液质联用技术测定大鼠cpuda及其代谢产物的含量。结果:1rt-pcr鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间thmrna(one-wayanova,f(4,22)=72.686,p<0.01)和datmrna(kruskal–wallistest,χ2=17.715,p<0.01)表达存在显著差异。各组间比较表明se-in组大鼠thmrna和datmrna的rq值较con-in组分别降低了36.17%和36.89%(p<0.01)。ptx+se-in组大鼠thmrna和datmrna的rq值较se-in组分别升高了47.76%和49.51%(p<0.01),恢复到con-in组水平。各对照组之间thmrna和datmrna的rq值无明显区别。腹腔给药组:ptx+se-ip组大鼠thmrna和datmrna的rq值较se-ip组分别升高了42.40%和46.73%(p<0.01),恢复到con-ip组水平。2免疫印迹结果鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间vm(th:f(4,22)=144.914,p<0.01;dat:χ2=14.314,p<0.01)、cpu(th:f(4,22)=50.721,p<0.01;dat:χ2=16.280,p<0.01)和hip(th:f(4,22)=18.219,p<0.01;3k,dat:χ2=17.015,p<0.01)th及dat与内参的相对吸光度比值显著不同。各组间比较表明,与con-in组相比,se-in组大鼠th和dat与内参免疫印迹条带的相对吸光度比值在vm、cpu和hip明显降低(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠th和dat与内参免疫印迹条带的相对吸光度比值在vm分别升高了282%和173%(p<0.01),在cpu分别升高了190%和100%(p<0.01),在hip分别升高了63%和290%(p<0.01),恢复至正常水平。腹腔给药组:与se-ip组相比,ptx+se-ip组大鼠th和dat与内参免疫印迹条带的相对吸光度比值在vm分别升高了270%和182%(p<0.01),在cpu脑区分别升高了144%和72%(p<0.01),在hip分别升高了40%和205%(p<0.01),dat在hip处的表达仍低于con-ip组水平(p<0.05)。3hplc-ms鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间在cpu的da(f(4,22)=49.223,p<0.01)、dapac(dopac:f(4,22)=29.512,p<0.01)和hva(hva:f(4,22)=33.023,p<0.01)含量明显不同。各组间两两比较发现,与con-in组比较,se-in组da及其代谢产物的含量明显下降(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠da、dopac和hva在cpu处分别升高了74%、33%和68%(p<0.01)。腹腔给药组:与se-ip组相比,ptx+se-ip组大鼠da、dopac和hva在cpu处分别升高了67%、43%和86%(p<0.01)。小结:1li-pc诱发癫痫发作大鼠的中脑da能神经活动减弱。2ptx预处理改善li-pc诱发癫痫发作大鼠中脑的da能神经活动。3鼻腔给予ptx对li-pc诱发癫痫发作大鼠中脑的da能神经活动活动的改善作用优于腹腔给药途径。第三部分ptx对li-pc诱发癫痫大鼠脑内nrf2-are通路的脑区特异性激活目的:观察ptx预处理对li-pc诱发癫痫大鼠脑内氧化应激参数、nrf2-are通路和camp含量的影响,探讨ptx对li-pc诱发癫痫大鼠中脑da能神经元保护的可能机制。方法:分光光度法检测vm和hip氧化应激参数(mda、lpo、gsh和sod);rt-pcr测定vm和hip的nrf2mrna、ho-1mrna和nqo1mrna的含量;免疫印迹分析vm和hip的nrf2、ho-1和nqo1蛋白改变;放免法检测vm和hip脑组织中camp的水平。结果:1氧化应激参数鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间mda(vm:χ2=17.033,p<0.01;hip:f(4,22)=35.598,p<0.01)、lpo(vm:χ2=16.419,p<0.01;hip:χ2=16.693,p<0.01)、gsh(vm:f(4,22)=66.059,p<0.01;hip:f(4,22)=68.995,p<0.01)和sod(vm:f(4,22)=37.864,p<0.01;hip:f(4,22)=12.912,p<0.01)在vm和hip含量存在显著不同。各组间比较表明,se-in组大鼠mda和lpo在vm和hip含量比con-in组显著升高(p<0.01),gsh和sod在vm和hip脑区含量比con-in组显著降低(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠mda在vm和hip脑区分别降低了14%和23%(p<0.01),lpo在vm和hip脑区分别降低了31%和30%(p<0.01),gsh在vm和hip脑区分别升高了78%和76%(p<0.01),sod在vm和hip分别升高了25%和19%(p<0.01)。con-in组、licl-in组和ptx-in组各氧化应激指标在观察脑区无明显区别。腹腔给药组:与se-ip组相比,ptx+se-ip组大鼠脑内mda在vm和hip脑区分别降低了19%和23%(p<0.01),lpo在vm和hip脑区分别降低了24%(p<0.01)和28%(p<0.01),gsh在vm和hip脑区分别升高了101%和86%(p<0.01),sod在vm和hip脑区分别升高了21%和22%(p<0.01)。con-ip组、licl-ip组和ptx-ip组各氧化应激指标在观察脑区无明显区别。2rt-pcr鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间nrf-2mrna(vm:f(4,22)=21.305,p<0.01;hip:f(4,22)=65.829,p<0.01)、ho-1mrna(vm:f(4,22)=21.598,p<0.01;hip:f(4,22)=37.175,p<0.01)和nqo1mrna(vm:χ2=15.963,p<0.01;hip:f(4,22)=66.175,p<0.01)表达存在显著差异。各组间比较表明,se-in组大鼠nrf2mrna,ho-1mrnaandnqo1mrna在vm和hip含量比con-in组明显降低(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠nrf2mrna,ho-1mrnaandnqo1mrna在vm分别升高了60%、38%和90%(p<0.01),在hip较se-in组无明显变化,仍然低于con-in组(p<0.01)。腹腔给药组:与se-ip组相比,ptx+se-ip组大鼠nrf2mrna,ho-1mrnaandnqo1mrna在vm分别升高了50%、41%和82%(p<0.01),在hip较se-ip组无明显变化,仍然低于con-ip组(p<0.01)。3免疫印迹:鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间nrf-2(vm:f(4,22)=84.169,p<0.01;hip:f(4,22)=65.157,p<0.01)、ho-1(vm:f(4,22)=71.535,p<0.01;hip:f(4,22)=82.190,p<0.01)和nqo1(vm:χ2=17.290,p<0.01;hip:f(4,22)=67.932,p<0.01)表达存在显著差异。各组间比较表明,与con-in组相比,se-in组大鼠nrf2,ho-1andnqo1在vm和hip脑区表达明显降低(p<0.01);与se-in组相比,ptx+se-in组大鼠nrf2,ho-1andnqo1在vm脑区分别升高了262%(p<0.01),121%(p<0.01)和65%(p<0.01),ptx+se-in组大鼠nrf2,ho-1和nqo1在hip脑区较se-in组无明显变化,仍然低于con-in组(p<0.01)。腹腔给药组:统计分析发现,与se-ip组相比,ptx+se-ip组大鼠nrf2mrna,ho-1mrnaandnqo1mrna在vm脑区分别升高了252%(p<0.01),129%(p<0.01)和36%(p<0.01),ptx+se-ip组大鼠nrf2,ho-1andnqo1在hip脑区较se-ip组无明显变化,仍然低于con-ip组(p<0.01)。4camp鼻腔给药组:con-in组、licl-in组、ptx-in组、se-in组和ptx+se-in组五组间camp含量在vm(one-wayanova,f(4,22)=9.829,p<0.01)和hip(kruskal–wallistest,χ2=15.319,p<0.01)存在显著差异。各组间比较表明se-in组大鼠camp含量在vm和hip处较con-in组分别降低了29.18%和23.90%(p<0.01);ptx+se-in组大鼠camp含量在vm和hip处较se-in组分别升高了32.47%和26.11%(p<0.01),恢复到con-in组水平。腹腔给药组:与con-ip组相比,se-ip组大鼠camp含量在vm和hip处分别降低了30.23%和25.84%(p<0.01);ptx+se-ip组大鼠camp含量在vm和hip处较se-ip组分别升高了31.90%和25.93%(p<0.01),恢复到con-ip组水平。小结:1 Li-Pc诱发癫痫发作大鼠的脑内氧化损伤增加、抗氧化能力减弱。2 PTX预处理特异性激活Li-Pc诱发癫痫发作大鼠中脑腹侧Nrf2-ARE通路、改善癫痫大鼠脑内的氧化应激状态。3 PTX预处理提高Li-Pc诱发癫痫发作大鼠VM和Hip的cAMP水平。4鼻腔给予PTX对氧化应激状态的改善优于腹腔给药。结论:1 PTX预处理降低Li-Pc诱发大鼠的癫痫发作,改善其认知功能障碍及中脑DA能神经元的功能活动。2 PTX预处理脑区特异性地激活Nrf2-ARE通路,改善癫痫大鼠脑的氧化应激状态。3鼻腔给予PTX对Li-Pc诱发大鼠癫痫发作的改善作用优于腹腔途径。