【摘 要】
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鱼类作为低等脊椎动物,已经进化出了适应性免疫。淋巴细胞作为适应性免疫功能的主要承担者,在受抗原刺激后可增殖、分化为不同功能的免疫细胞以应对抗原入侵。本实验室前期研究已证实大黄鱼（Larimichthyscrocea）白细胞介素2可促进T、B淋巴细胞的增殖与分化,但具体调控机制尚不清楚。MicroRNA作为一种高度保守的小片段RNA,在生物体的各生命过程中具有广泛调控作用,在哺乳动物中已证实可参与调
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鱼类作为低等脊椎动物,已经进化出了适应性免疫。淋巴细胞作为适应性免疫功能的主要承担者,在受抗原刺激后可增殖、分化为不同功能的免疫细胞以应对抗原入侵。本实验室前期研究已证实大黄鱼（Larimichthyscrocea）白细胞介素2可促进T、B淋巴细胞的增殖与分化,但具体调控机制尚不清楚。MicroRNA作为一种高度保守的小片段RNA,在生物体的各生命过程中具有广泛调控作用,在哺乳动物中已证实可参与调控淋巴细胞的增殖与分化,但在鱼类未见相关报道。本研究中,我们用终浓度为200 ng/mL的重组大黄鱼白细胞介素2蛋白（rLcIL-2）及重组绿色荧光蛋白（rGFP）刺激体外分离培养的原代大黄鱼头肾淋巴细胞,通过illumina高通量测序,获得了 rLcIL-2刺激后头肾淋巴细胞microRNA的表达谱,发现各样品中表达量最高的前3种microRNA均为dre-miR-21、dre-miR-146a、dre-miR-22a-3p。在rLcIL-2和对照rGFP蛋白刺激的细胞中差异表达的microRNA共33种,其中显著上调的20种,包括dre-miR-146a、dre-miR-155、dre-miR-731-5p等;显著下调的 1 3 种,包括 ssa-miR-21a-5p、dre-miR-143、dre-miR-200c-3p等。运用miRanda、RNAhybrid软件共预测到这33个差异表达microRNA 的靶基因 13075 个,包括 STAT3、Bcl-6、caspase3、Bmf、IL-2 等。在差异表达的microRNA中,miR-146a在免疫、营养、抗病毒等方面具有广泛调控作用,且在哺乳动物中已被证实可参与淋巴细胞的增殖与分化,故选择其为主要研究对象,结合miRanda、RNAhybrid软件对其进行靶基因预测并扩增获得这些靶基因的3’UTR序列,将其插入不同的报告质粒或表达载体中,结合双荧光素酶活性分析、绿色荧光蛋白荧光强度观察及Western Blot分析确证其可靶向大黄鱼白细胞介素2基因（LcIL-2）、B细胞淋巴瘤-2修饰因子基因（LcBmf）的3’UTR并负调控其表达。通过对此两基因3’UTR上与miR-146a“种子序列”结合位点的定点突变,确认了 miR-146a“种子序列”与LcIL-2或LcBmf3’UTR区域的具体结合位点。
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