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G-三联体(G-triplex,G3)是由富含鸟嘌呤(G)的DNA序列形成的一种特殊的核酸二级结构,它是由3个“-GGG-”单元通过氢键形成一个G-三分体(G-triad),再由两个或多个G-triad通过堆积作用形成的。hemin自身具有较低的催化活性,而G-triplex与hemin结合后可以大大提高hemin的催化活性。到目前为止,G-triplex/hemin DNAzyme作为一种新型的过氧化物模拟酶,在生物传感体系中的应用还相对较少,与信号放大策略的联用更是非常有限。本论文以G-triplex/hemin DNAzyme作为信号探针,结合等温循环级联信号放大技术和滚环扩增技术,建立了简单灵敏检测核酸的生物传感新方法。具体研究内容如下:一、基于等温循环级联信号放大的G-triplex/hemin DNAzyme比色法检测HIV-DNA本研究将G3/hemin DNAzyme作为信号探针,结合等温指数扩增(EXPAR)技术,建立了一种简单灵敏检测人类免疫缺陷病毒DNA(HIV-DNA)的比色新方法。在该方法中,目标HIV-DNA与模板杂交引发EXPAR反应,生成大量富G短链,在K+诱导下,富G短链形成G3结构,G3与hemin自组装形成具有过氧化物酶活性的G3/hemin DNAzyme。G3/hemin DNAzyme催化H2O2氧化2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS),使体系产生颜色变化,通过测定420 nm的吸光度变化来检测不同浓度的HIV-DNA。该方法的检出限为4.7 fM。此外,我们也以G-quadruplex/hemin DNAzyme(G-quadruplex,即G-四联体或G4,由富含4个“-GGG-”单元的核酸序列折叠形成)作为信号探针,结合EXPAR技术检测了目标DNA。实验结果表明:G3-EXPAR体系的检出限比G4-EXPAR的检出限低10倍。可见,G3/hemin DNAzyme是EXPAR生物传感平台一种优良的信号探针。本工作为构建灵敏的信号放大策略提供了新思路,进一步扩展了G3在生物传感平台中的应用。二、基于滚环扩增信号放大的G-triplex/hemin DNAzyme比色法检测miRNAG4/hemin DNAzyme是滚环扩增(RCA)常用的信号探针,当两个G4直接相连时,G4二聚体与hemin形成的G4/hemin DNAzyme催化活性会受到影响。而我们发现G3三聚体(三个G3直接相连)与hemin形成的G3/hemin DNAzyme催化活性不会受到影响。因此,本研究将RCA技术与G3/hemin DNAzyme相结合,构建了一种简单灵敏检测miRNA的比色新方法。该方法中,把锁式探针设计为含有G3三聚体的互补序列,通过滚环扩增反应,产生大量G3三聚体的重复串联单元,在K+诱导下,G3三聚体与hemin自组装形成G3/hemin DNAzyme,催化ABTS-H2O2体系产生颜色变化,通过比色信号的响应达到灵敏检测miRNA的目的。该方法的检出限为37.1 fM,其检出限比G4/hemin DNAzyme(两个G4直接相连的G4二聚体与hemin自组装形成)为信号探针的检出限低15.6倍。该方法为提高检测目标的灵敏度和构建新型的G3三聚体传感探针提供了新思路。三、以原位合成的铜纳米簇为荧光探针的免疫分析新方法的研究碱性磷酸酶(ALP)能够催化水解L-抗坏血酸-2-磷酸三钠产生抗坏血酸,在DNA模板存在的情况下,抗坏血酸可以还原Cu-2+原位产生具有荧光的铜纳米簇(CuNCs)。CuNCs的荧光强度随ALP活性增大逐渐增强,检出限为0.006 U/L。而ALP是酶联免疫分析法(ELISA)中常用的标记酶,基于此,构建了一种检测模型抗原人免疫球蛋白G(IgG)的荧光免疫策略。该方法在0.05-12 ng/mL范围内与CuNCs的荧光强度有良好的线性关系,检出限为7 pg/mL,远低于很多之前报道的ELISA方法的检出限。该方法简单快速,成本低廉,灵敏度高,对于拓展商用ALP标记ELISA具有广阔的应用潜能。