眼斑芫菁(Mylabris cichorii)是鞘翅目(Coleoptera)芫菁科(Meloidae)斑芫菁属(Mylabris)的昆虫,是一种世界范围内使用历史悠久的民间药,也是中国药典收录的重要动物药材之一。斑蝥素是芫菁科昆虫在受到外界刺激时分泌的一种倍半萜类防御性毒素,其合成具有性二型现象,即雄成虫大量合成斑蝥素,而雌成虫几乎不合成,雄虫在交配时将斑蝥素作为一种“信物”传递给雌虫,进而由雌虫在产卵时传递给卵作为防卫毒素。近年来由于发现斑蝥素对多种癌症具有显著疗效而广泛受人关注,也导致其需求量大幅增加,目前芫菁科昆虫已被列为紧缺的动物药之一。尽管前人对芫菁科昆虫有不少的的研究,但都主要集中于生物学、生理学、生态学、人工养殖、抗癌机理等方面,对斑蝥素生物合成途径的研究甚少,至今斑蝥素生物合成的分子机制仍不清楚。斑蝥素作为一种毒素如何在芫菁体内合成及代谢对于揭示这一生命现象的奥秘具有重要科学价值,同时也可以为野生资源的合理开发利用以及斑蝥素的体外生物合成提供理论依据。本研究以转录组及数字基因表达谱测序(RNA-seq)为基础,通过代谢通路分析,筛选出可能与斑蝥素生物合成相关的基因,并对其中部分重要基因的功能进行了研究,探索斑蝥素生物合成的分子机制,取得的主要研究结果如下:(1)转录组de novo(从头)测序及数字基因表达谱分析鉴定斑蝥素生物合成可能相关的基因及通路由于眼斑芫菁尚无基因组数据,本研究开展了眼斑芫菁雌、雄成虫混合转录组de novo测序,得到了9.19 G的数据,最终组装成了29,247个unigene,其中23,739个unigene(81.17%)被注释。有8,580条序列得到了COG分类注释,并分配至25个类别,12,951条序列被分到了58个GO条目上,16,660条序列分布于258个KEGG通路中,共预测了24,358条编码蛋白序列。分别对雌、雄成虫斑蝥素合成高峰期20-25 d的数字基因表达谱测序分析后,获得了2,465个差异表达基因,其中1,468个基因在雄虫组中上调表达,997个基因下调表达,有1,506个差异表达基因被富集到了249个KEGG通路中。通过分析与斑蝥素生物合成途径可能相关的KEGG通路,鉴定了14个可能与斑蝥素合成相关的基因,发现眼斑芫菁中斑蝥素的生物合成只能通过甲羟戊酸途径(mevalonate pathway,MVA pathway)途径,不能通过1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸/2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(DXP/MEP pathway)或两种途径的结合形式。此外,我们认为斑蝥素的生物合成可能与保幼激素的合成或代谢有关。随后,对具有代表性的显著差异表达的13个unigene进行了荧光定量PCR(rt-qpcr)验证,证明了转录组和表达谱测序分析的可靠性。(2)mcste24、mccyp305a1、mcjheh基因全长cdna的克隆及生物信息学分析本研究运用染色体步移及3’race技术对雄性表达谱库中上调表达的全反式法呢醇合成支路中的ste24肽链内切酶基因ste24、可能与保幼激素合成相关的基因cyp305a1和保幼激素环氧化物水解酶基因jheh进行了克隆,分别获得了1237bp、1601bp和1497bp的全长cdna,编码433个、492个和459个氨基酸,并分别将它们命名为mcste24(genbank登录号ku941585)、mccyp305a1(genbank登录号ku941587)和mcjheh(genbank登录号ku941586)基因。生物信息学分析发现,这三个基因所编码的蛋白与昆虫中其相应的蛋白存在高度的同源性:mcste24蛋白结构中存在ste24蛋白所共有的hexxhzn2+-金属蛋白酶信号;mccyp305a1蛋白具有构成cyp超家族酶催化中心的保守基序,如hinge、ihelix、helixk、hemebindingloop;mcjheh蛋白具有环氧化物水解酶特有的催化三联体和六个与阴氧离子洞形成相关的氨基酸残基。(3)mcste24、mccyp305a1、mcjheh基因在雌、雄成虫不同时期的表达模式分析通过rt-qpcr对mcste24、mccyp305a1、mcjheh基因进行不同时期的表达模式分析发现,这三个基因在雌、雄成虫各个时期均有表达。在雄虫中,三个基因在羽化后的5-10日龄的表达量具有较高或升高的趋势,在15日龄时均有明显的下调表达,而在20-25日龄各基因的表达量又显著上调,25日龄达到高峰之后,25-30日龄表达量急剧下降,各基因在斑蝥素大量合成前期至大量合成后期的表达变化趋势与斑蝥素含量变化趋势呈正相关,说明这三个基因可能参与斑蝥素的生物合成;此外,在羽化后5-10日龄三个基因的表达量均偏高说明这三个基因可能还与羽化初期雄虫的性腺发育有关。在雌虫中,三个基因在5-10日龄表达量较低或有降低趋势,在15日龄时表达量突然急剧上升且达到高峰,20-25日龄又显著降低,而在30日龄表达量又有所回升,各基因的表达模式与斑蝥素含量变化不呈正相关,由于雌虫本身不能大量合成斑蝥素,因而这三个基因可能参与了雌虫其他生理活动,如卵巢发育、促进卵黄发生、产卵等。比较雌、雄成虫斑蝥素大量合成前期及高峰期mcste24、mccyp305a1及mcjheh基因的差异表达模式可以看出,在斑蝥素大量合成前期(15d),雄虫中的各基因表达量都比较低,有些甚至显著低于雌虫组(mcste24、mccyp305a1基因);而在斑蝥素大量合成期(20-25d),雄虫体内三个基因表达量都有急剧的上升,25d时均超出雌成虫表达量的若干倍,而此时雄性性腺已基本成熟,考虑到眼斑芫菁斑蝥素合成的性二型现象及雄虫蝥素合成的能力,可以推测这三个基因此期的功能应该与斑蝥素合成相关。(4)McSTE24、McCYP305a1、McJHEH基因的RNA干扰通过体外合成McSTE24、McCYP305a1、McJHEH基因的双链RNA(ds RNA),并用微量注射器注射dsRNA的方式对羽化后第19日龄的雌、雄成虫进行RNA干扰发现,干扰这三个基因均对雌、雄虫斑蝥素的合成造成了影响。干扰组的斑蝥素含量比对照组显著下降,说明这三个基因均可以直接参与斑蝥素的生物合成;同时还说明眼斑芫菁的雌虫也可以产生少量斑蝥素,但斑蝥素含量测定发现,无论是干扰组还是对照组,雄虫体内的斑蝥素含量均远高于雌虫,说明雄虫斑蝥素合成能力强于雌虫,这与斑蝥素合成的性二型现象相符,至于雌虫产生斑蝥素的原因还需进行深入研究。由于McJHEH可能是眼斑芫菁保幼激素代谢相关的酶基因,对该基因干扰后斑蝥素含量的降低表明眼斑芫菁斑蝥素合成可能与保幼激素的代谢相关,但还需进一步研究证实。(5)干扰后对下游基因表达量的影响对干扰后的McSTE24和McCYP305a1基因各自的下游基因进行了表达量变化分析,发现对McSTE24基因的干扰直接影响了McCYP305a1基因的表达,但对McJHEH的作用似乎是一种由于前体的持续阻断而导致的负调控现象。对McCYP305a1基因的干扰结果显示,McCYP305a1基因可能并不直接控制McJHEH基因的表达,而是由于干扰McCYP305a1基因影响了保幼激素的合成而导致保幼激素滴度失调,从而影响到McJHEH基因的表达。综上所述,斑蝥素的生物合成途径有多种酶参与,存在复杂的激素调节机制,是个庞杂的过程。本研究构建了首个眼斑芫菁成虫转录组及斑蝥素合成高峰期表达谱数据库,发现了芫菁科昆虫中未报道过的三个与斑蝥素合成相关的基因,明确了它们在眼斑芫菁斑蝥素生物合成中的功能,初步探索了眼斑芫菁成虫斑蟊素生物合成途径,为芫菁科昆虫的分子遗传学研究奠定了基础。