磁原位电化学发光和核酸试纸条技术及其在食源性致病微生物检测中的应用

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轮状病毒一种双链RNA病毒,属于肠道病原体,是婴幼儿病毒性腹泻最常见的病原之一。中国每年约有3.5万人死于轮状病毒感染,死亡率居世界第二。因此,开发快速、灵敏的轮状病毒检测方法对于防止轮状病毒感染和疾病暴发具有重大意义。RT-PCR具有高特异性和灵敏度,被广泛用于病毒检测。电化学发光所具有的灵敏度高、特异性好和成本低等优点使其成为分析和临床应用上的强大工具。本文提出了一个基于磁原位扩增和电化学发光技术相结合的检测轮状病毒的方法。实现的方法是,先按传统方法进行反转录,再将反转录所得到的轮状病毒cDNA用于磁原位扩增。为了在磁珠上进行扩增并实现电化学发光检测,我们向扩增体系中引入两种功能引物:一是磁性引物,通过将上游引物与磁珠共价连接获得;二是TBR引物,通过在下游引物上标记三联吡啶钌获得。借助于磁性引物和TBR引物,经过变性、退火、延伸多个循环之后,带有三联吡啶钌标记的双链产物在磁珠上大量富集,接着,磁珠-产物的复合物不需要经过孵育或者修饰过程,而被重悬在ECL分析缓冲液中,并在由实验室组装好的ECL检测系统里检测。这样做既避免了一些人工操作又能达到快速灵敏的检测目的。运用此方法,我们在一个半小时之内成功地对临床粪便样品中的轮状病毒进行了检测,检测的灵敏度达到0.2 pg/μL。在浓度为0.2pg/μL至400 pg/μL时,其电化学发光强度呈线性。另外,通过与其他样品的检测结果相比较,我们提出的方法显示出良好的特异性。我们有理由相信我们提出的方法能被应用于食品安全和临床诊断等领域中。单增李斯特菌作为食源性致病菌广泛存在于我们的生活环境中,孕妇、老人和免疫力低下者食用被单增李斯特菌污染的食品,容易引起流产、肠胃炎、败血症等李斯特菌病。因此,我们提出了一种基于依赖核酸序列扩增的核酸试纸条技术检测单增李斯特菌的方法。依赖核酸序列扩增技术是一种特别适合扩增RNA的恒温扩增技术,它克服了PCR依赖于热循环这一缺点,同时具有比PCR效率更高的可靠的扩增能力,且具有较高的特异性。核酸试纸条技术具有简单快速等优势。将依赖核酸序列扩增技术与试纸条检测相结合既能使操作快速简单又能保证检测的灵敏度。该方法将会成为食源性致病微生物现场快速检测和临床诊断等方面的强有力的工具。
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