【摘 要】
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黑枸杞作为青藏高原特色野生药用植物,因含有丰富的花青素,被誉为“花青素之王”,大量研究发现:青藏高原黑枸杞花青素具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等多种生物功效。本研究拟以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,1)采用流式细胞术,扫描电镜,RT-q PCR及Western Blot法检测不同浓度花青素及结合JNK通路抑制剂SP600125诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7后对细胞凋亡率、细胞形态、凋亡因
【基金项目】
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青海省科学技术厅应用基础研究项目（2018-ZJ-759）；
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黑枸杞作为青藏高原特色野生药用植物,因含有丰富的花青素,被誉为“花青素之王”,大量研究发现:青藏高原黑枸杞花青素具有抗炎、抗氧化、提高免疫力等多种生物功效。本研究拟以小鼠巨噬细胞RAW264.7为研究对象,1)采用流式细胞术,扫描电镜,RT-q PCR及Western Blot法检测不同浓度花青素及结合JNK通路抑制剂SP600125诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7后对细胞凋亡率、细胞形态、凋亡因子及JNK信号通路因子mRNA及蛋白表达的影响;2)采用CCK8法,测定H2O2诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7活力及黑枸杞花青素对H2O2诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞凋亡机制的影响;3)探讨黑枸杞花青素结合自噬抑制剂3-MA对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响,4)研究黑枸杞花青素结合JNK凋亡通路抑制剂SP600125对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬的影响。基于细胞水平探究黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡及凋亡与自噬相互作用分子机制。以期为黑枸杞花青素作为免疫增强剂的开发利用提供理论基础。主要研究内容和结果如下:1.不同浓度黑枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响与对照组相比,花青素组可显著降低小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡率（P＜0.05）;极显著降低Caspase-3、Bax、Bax/Bcl-2的mRNA及蛋白表达（P＜0.01）,极显著增高Bcl-2的mRNA及蛋白表达（P＜0.01）,表明黑枸杞花青素能抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡且呈剂量依赖性。2.黑枸杞花青素及结合JNK通路抑制剂SP600125对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响与对照组相比,花青素组极显著降低JNK通路因子JNK mRNA及p-JNK蛋白表达量（P＜0.01）且呈剂量依赖性;花青素结合SP600125对JNK通路关键因子的影响,与对照组相比,花青素组、SP600125组与花青素+SP600125组极显著降低小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡率（P＜0.01）;花青素+SP600125组极显著降低JNK通路因子JNK的mRNA及p-JNK蛋白表达量（P＜0.01）;与SP600125组相比,花青素+SP600125组极显著降低小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡率（P＜0.01）。极显著降低JNK通路因子JNK的mRNA及p-JNK蛋白表达量（P＜0.01）,说明黑枸杞花青素通过JNK凋亡通路抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡。3.黑枸杞花青素对H2O2诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响CCK-8结果表明,50、100、150、200、250μmol/L H2O2组诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 12、24、36、48、72 h均有效降低小鼠巨噬细胞RAW264.7活率,H2O2建立小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡模型的最佳方案为:200μmol/L H2O2诱导24 h。H2O2诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7后,花青素极显著降低小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡率（P＜0.01）。极显著降低Caspase-3、Bax的mRNA及蛋白表达量（P＜0.01）;极显著升高Bcl-2的mRNA及蛋白表达量（P＜0.01）;极显著降低JNK通路因子JNK mRNA及p-JNK蛋白的表达量（P＜0.01）,表明黑枸杞花青素通过JNK通路抑制H2O2诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡。4.黑枸杞花青素结合自噬抑制剂3-MA对小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响与对照组相比,花青素组,3-MA组及花青素组+3-MA组极显著降低小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡率、Caspase-3、Bax/Bcl-2比值、JNK的mRNA及p-JNK的蛋白表达量（P＜0.01）;极显著增高Bcl-2的mRNA表达量（P＜0.01）;与3-MA组相比,花青素+3-MA组显著降低Caspase-3、JNK的mRNA表达量（P＜0.05）;极显著降低小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡率、Bax、Bax/Bcl-2比值的mRNA及p-JNK的蛋白表达量（P＜0.01）;显著增高Bcl-2的mRNA表达量（P＜0.05）;说明抑制自噬能增强黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7凋亡。5.黑枸杞花青素结合JNK通路抑制剂SP600125对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬的影响与对照组相比,花青素组、SP600125组与花青素+SP600125组极显著降低LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达量（P＜0.05）,极显著降低LC3-Ⅱ、Beclin-1的蛋白表达（P＜0.01）,与SP600125组相比,花青素组+SP600125组显著降低LC3-Ⅱ、Beclin-1的mRNA表达量（P＜0.05）,极显著降低LC3-Ⅱ的蛋白表达（P＜0.01）,说明抑制凋亡能增强黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬。
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