由炭疽菌(Glomerella cingulata)引起的苹果炭疽叶枯病(Glomerella leaf spot,GLS)，是近年来在我国新发现的一种苹果病害，主要危害苹果叶片和果实。炭疽叶枯病不仅危害严重，且流行性极强，目前，对于苹果炭疽叶枯病的防控主要依靠化学药剂，频繁使用化学杀菌剂不仅使果园生态环境恶化，给食品安全带来极大隐患，而且炭疽叶枯病发病迅速，潜育期只有2~4 d，病原菌一旦侵入寄主组织，几乎没有用药防治时间。如该病无法得到有效控制，‘嘎啦’、‘秦冠’等感病优良品种面临被淘汰的危险。因此，寻找新的、安全有效的措施防治苹果炭疽叶枯病害显得尤为迫切和重要。菌株A-1(Streptomyces rochei)是本实验室从健康‘富士’苹果果实内分离鉴定的内生菌，研究发现其对多种果树病原真菌具有拮抗作用，且能显著诱导苹果对果实轮纹病的抗性。本研究以内生菌株A-1、炭疽叶枯病菌强致病力菌株GLS030206和‘嘎啦’苹果幼树为材料，研究内生菌株A-1代谢物诱导苹果抗炭疽叶枯病的机制，并通过对内生菌株A-1代谢单体活性化合物的研究，以期明确活性化合物防治炭疽叶枯病的应用潜能。研究结果如下：　　1.研究了菌株A-1代谢物诱导苹果对炭疽叶枯病的抗性，研究发现菌株A-1发酵液可显著提高感病苹果品种‘嘎啦’对炭疽叶枯病的抗性，喷施菌株A-1发酵液后间隔3 d接种炭疽叶枯病菌GLS，其防效高达92.78%；喷施后21 d，其防效仍达45%以上，暗示菌株A-1代谢物在防治苹果炭疽叶枯病上具有巨大的开发和应用潜能。　　2.对菌株A-1代谢物处理后‘嘎啦’叶片中的防御酶活性动态变化进行了测定，结果表明菌株A-1代谢物处理后再接种GLS，叶片中防御相关酶活性均显著升高，其中过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性于接种后3 d达到峰值，分别为201.3 U·g-1·(FW)·min-1和38.2 U·g-1(FW)·min-1，接种后7 d苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性分别为对照的9.1和5.2倍。同时，系统分析了A-1代谢物诱导‘嘎啦’抗炭疽叶枯病的信号转导机制，结果显示，菌株A-1发酵液处理后再接种GLS，叶片中水杨酸(SA)信号途径关键基因显著上调表达，病程相关蛋白(PR)基因PR1和PR5表达量均于处理后120 h达到峰值，分别为单独接种GLS处理的3.5和16.7倍；茉莉酸(JA)途径关键基因冠菌素不敏感1(Coronatine insensitive1,COI1)表达量与对照相比无显著差异，乙烯(ET)信号途径关键基因组成型三重反应1(Constitutive triple response1,CTR1)表达量升高不明显，乙烯响应因子3(Ethylene response factor3,ERF3)表达量显著升高，然而该基因阻遏乙烯诱导基因启动子的转录，属乙烯信号转导的负调控因子。为进一步验证菌株A-1代谢物诱导苹果抗病的信号转导途径，对SA合成途径关键基因水杨酸诱导缺陷2(Salicylic-acid-induction deficient2,SID2)， SA信号通路激活剂基因增强感病性1(Enhanced disease susceptibility1,EDS1)、肽酰基精氨酸脱亚胺酶4(Protein-argininedeimina4,PAD4)及衰老相关基因101(Senescence-associated gene101,SAG101)的表达进行了分析，结果显示，菌株A-1代谢物处理后再接种GLS，叶片中上述基因均显著上调表达，于接种后12~48 h表达量达到峰值。　　3.利用外源SA、茉莉酸甲酯(MeJA)和氨基环丙烷羧酸(ACC)对‘嘎啦’幼树进行喷雾处理，结果表明仅SA可显著提高‘嘎啦’对炭疽叶枯病的抗性。在此基础上建立了外源SA诱导苹果抗炭疽叶枯病的技术体系，喷施0.2 mM SA后2 d接种GLS，发病叶片病斑数减少64.4%，病情指数降低50.1%。外源SA处理后再接种GLS，‘嘎啦’叶片中过氧化氢(H2O2)含量、防御酶活性和病程相关蛋白基因表达水平均显著升高；SA+GLS处理后1 d时H2O2含量达到峰值为4.5 mmol g-1 FW，CAT活性与单独SA处理和接种GLS相比分别升高76.9%和39.3%，超氧化物歧化酶(SOD)活性和总抗氧化能力(T-AOC)分别是单独接种GLS的1.2倍和1.3倍；与对照相比，SA+GLS处理后5 d，PR1、PR5、PR8和β-1,3-葡聚糖酶基因的表达量分别升高了112.4倍、226.0倍、154.9倍和93.3倍。上述结果进一步证实菌株 A-1代谢物诱导苹果抗炭疽叶枯病的机制与启动SA信号转导途径密切相关。　　4.菌株 A-1发酵液经乙酸乙酯萃取后，进行高效液相色谱(HPLC)检测，发现有机相中主要存在三种浓度较高的化合物，对其中一个化合物2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)进行了分析。对BHT防治苹果炭疽叶枯病的效果进行了测定，外源喷施0.1 mM BHT后再接种GLS，其防效达45.8%。室内离体抑菌实验结果显示，0.1 mM BHT对GLS菌丝生长和孢子萌发均无明显影响，表明BHT防治苹果炭疽叶枯病的机制不是抑菌作用，而是诱导了植物抗病性。　　5.在上述研究基础上，研究了外源BHT诱导‘嘎啦’对炭疽叶枯病的抗性，并初步探究了其诱导抗病机制。结果显示，外源BHT处理可显著提高寄主防御相关酶活性，其中BHT+GLS处理组中MDA含量于接种后4 d才显著高于对照，H2O2含量显著升高且1 d时达到峰值，CAT、POD、PPO活性及T-AOC持续升高，均于3 d时达到最大值，其活性比单独接种GLS分别高出24.7%、54.4%、64.8%和21.5%，SOD和PAL活性持续升高且始终维持在较高水平。此外，BHT处理可显著诱导病程相关蛋白及SA信号转导途径关键基因的上调表达，与单独接种GLS相比，120 h时几丁质酶和PR1基因的表达量分别升高了5.7倍和9.7倍，而β-1,3-葡聚糖酶和PR5基因的表达量分别升高80.6%和79.7%。　　本研究明确了菌株A-1代谢物诱导苹果对炭疽叶枯病的抗性效果，及其生化机制和信号转导途径，并对代谢产物中一个活性化合物的诱导抗病效果和机制进行了探究。本研究结果不仅为苹果-炭疽叶枯病菌互作机制研究提供了可靠的技术手段，而且利用诱导抗病性防控植物病害具有抗性持续时间长、抗病谱广及不污染环境等优点，菌株A-1代谢物中的诱导抗病活性物质具有巨大的应用潜能，有望开发成植物抗病激活剂，为苹果炭疽叶枯病安全防控提供一种新策略和可行途径，具有重要的理论价值和现实意义。