研究背景： β地中海贫血(β-thalassemia，β-地贫)是由于编码β珠蛋白基因的点突变或核苷酸序列缺失造成β链合成减少或缺如、α/非α链不平衡，导致未匹配的α珠蛋白链过剩、沉淀，加速红细胞前体细胞在骨髓中的过早破坏和凋亡而形成的无效造血。天然药物的研究和应用使疾病的防治进入一个崭新的阶段，部分方剂能缓解地贫的贫血症状，减少输血量，代偿因β-珠蛋白基因缺陷而造成的Hb生成不足，提高Hb。中药特有的理论体系和治疗方法，在治疗地贫上积累了丰富的临床用药经验。 根据中医的“补气生血”理论，黄芪(Astragalusmembranaceus，AM)为诸多补血或补气方剂中的重要组成成分，对造血系统有着广泛的影响。黄芪味甘，性微温，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌等功效。其成分复杂，含黄芪多糖(Astragaluspolysaccharide，APS)、黄芪苷(Astragalosides，AST)、黄酮、单糖、生物碱、叶酸、多种氨基酸、维生素、苦味素及锌、硒、铁等14种人体所需的微量元素。动物实验显示：在2.85-39.9g/kg范围，用药安全，无明显的毒副作用。现代药理研究发现，黄芪具有清除自由基、抗缺氧、强心、降压、改善微循环、心肌保护、抑制血小板聚集及免疫调节等多方面的药理作用，而对红细胞增殖分化及诱导γ-珠蛋白表达的研究报道不多。本课题组前期研究已证实单味黄芪具有诱导K562细胞向红系分化的作用：可提高联苯胺染色阳性细胞率、增加Gγ-mRNA表达、提高HbF。是黄芪中的何种成分诱导K562细胞向红系分化?可影响哪些珠蛋白的表达?通过哪些相关的基因起作用?这些问题尚不清楚。 研究发现一些基因如LMO2、SCL、Bra、Flk-1、Runx1、GATA-1、GATA-2、EKLF、BKLF、NFE2、EpoR等可调控红系分化、珠蛋白基因表达，它们的表达水平随红系发育和分化进行而改变，在红系分化早期、红系祖细胞增殖、终末分化及珠蛋白转换过程中发挥关键性的作用。既往研究多为单基因或少数几个基因的表达，各研究间缺少更直接的联系，大量的信息都是孤立的。20世纪90年代诞生的基因芯片技术，与传统基因研究方法相比，具有无可比拟的高信息量、高通量，可以快速、准确地分析数以千计的基因组信息，具有极高的工作效率。可较直观地反映不同条件和状态下的基因转录调控水平，从而为寻找基因调控机理提供了一条有效的途径。对药物作用后的差异表达基因分析，有助于从宏观上了解药物作用后细胞基因表达谱的改变，在分子层面探索药物的作用机制，明确药物作用靶点。 目的： 提取单味中药黄芪的不同成分直接作用K562细胞，筛选出黄芪诱导K562细胞向红系分化的有效成分。应用黄芪有效成分直接作用K562细胞进行基因表达谱芯片分析，筛选出差异表达的珠蛋白基因及与红系分化相关的基因，从分子水平了解黄芪的药物作用靶点及可能的作用机制，为药物的临床应用提供理论及实验依据，为治疗地中海贫血的药物研发开辟新的途径。 方法： 1、黄芪有效成分筛选 1.1超声醇提水提法提取黄芪根，用所得提取物浓度为4mg/ml(生药计)的AST和APS分别作用K562细胞，于诱导后24、48、72、96h各时间点行联苯胺染色，记录各组不同时间点的联苯胺染色阳性细胞率(BZ％)及阳性细胞总数(NBZ)，观察K562细胞向红系分化的变化。丁酸钠(sodiumbutyrate，NaB)为阳性对照组，未加处理因素组为阴性对照组。 1.2APS不同浓度50、100、200、400ug/ml(多糖计)分别诱导K562细胞，联苯胺染色动态检测其向红系分化的诱导作用，测定药物的作用浓度及作用时间。 1.3RT-PCR检测APS、NaB作用后Cγ-mRNA表达。 1.4Western-blot检测APS、NaB作用后HbF表达。 1.5四唑盐比色法(MTT)测定APS作用K562细胞后的细胞活性，检测APS对细胞增殖的影响。 2、基因表达谱分析 2.1应用Affymetrix公司的人类全基因组“HG-U133Plus2”芯片，筛选出APS作用K562细胞后的差异表达基因。 2.2RT-PCR方法验证α、β、Aγ、Gγ、δ、ε及ζ7个珠蛋白基因，选择芯片中表达、不表达、上调及下调的与红系分化相关的基因EKLF、BKLF、LMO2、NFE2、GATA1、GATA2、FKLF、SP1、CP1、NFE4进行RT-PCR验证。 结果： 1、黄芪有效成分筛选 1.14mg/mlAPS、4mg/mlAST、0.5mmol/LNaB分别诱导K562细胞后BZ％峰值分别为13.2％，2.9％，17.5％，各组BZ％比较差异有统计学意义(F=285.348，P=0.000)。APS组24、48、72hBZ％低于NaB组，96hBZ％高于NaB组(F=218.082，P=0.000)。AST组24、48、72、96hBZ％均低于NaB组(P=0.000)，与未加处理因素的对照组比较差异无统计学意义(P=0.333)。4mg/mlAPS、4mg/mlAST、0.5mmol/LNaB诱导后NBZ峰值分别为104776.7±4909.3、26675.3±2515.7及80475.3±6065.3，组间比较差异有统计学意义(F=468.094，P=0.000)。APS组24、48h的NBZ低于NaB组，72、96h的NBZ高于NaB组(F=228.127，P=0.000)。AST组24、48、72及96h的NBZ与未加处理因素的对照组比较(P=0.264)，差异无统计学意义。 1.2取浓度为50、100、200、400ug/mlAPS分别诱导K562细胞，联苯胺染色发现各组均有诱导K562细胞向红系分化的作用，组间比较差异有统计学意义(F=496.094，P=0.000)。各浓度组中以200ug/ml组的BZ％值最高，诱导后72h达峰值(14.13±0.65)。 1.3RT-PCR检测APS作用K562细胞后Gγ-mRNA表达明显增加，其相对表达量为0.4938±0.009，NaB阳性对照组为0.5351±0.010，未加处理因素的对照组为0.1157±0.012，不同处理组间比较(F=1446.178，P=0.000)，差异有统计学意义。 1.4Western-Blot检测APS作用K562细胞48h的HbF表达量明显上调，其相对表达量为0.9322±0.030，NaB阳性对照组为1.0215±0.024，未加处理因素的对照组为0.2653±0.030。不同处理组间比较(F=641.356，P=0.000)，差异有统计学意义。 1.5MTT法测定吸光度OD值显示，组间比较差异有显著意义(F=176.481，P=0.000)，与对照组比较，APS、AST对K562细胞的增殖无明显影响(P=0.276，P=0.106)，而NaB有明显影响细胞增殖的作用(P=0.000)。 2、基因表达谱芯片分析 2.1APS作用K562细胞后表达上调2倍以上的基因31个，表达下调2倍以上的基因108个。差异表达基因的生物学功能主要是参与蛋白质结合、细胞代谢过程、细胞增殖、转录激活、生物学调节及信号转导等。 2.2APS作用K562细胞后γ-珠蛋白基因表达上调，而α、β、δ、ε及ζ珠蛋白基因无明显改变。与红系分化相关的基因LMO2、Runx1、GTF2I表达均上调；BKLF、EKLF、EPHB4及Sp1的表达均下调；而GATA1、GATA2、NF-E2等的表达无改变。 2.3RT-PCR检测与芯片结果一致。 结论： 1、首次证明中药黄芪诱导K562细胞向红系分化的有效成分是APS，可使联苯胺染色阳性细胞增加、Gγ-mRNA表达增加、HbF的表达增加。 2、APS细胞增殖无影响。 3、首次应用APS诱导K562细胞进行基因表达谱分析，差异表达基因的生物学功能主要是参与蛋白质结合，细胞增殖，转录激活，生物学调节及信号转导等。 4、APS作用K562细胞后可使γ珠蛋白基因表达上调，α、β、δ、ε及ζ珠蛋白基因无明显改变。 5、APS作用K562细胞后可使红系分化相关的基因LMO2、Runx1、GTF2I表达上调；BKLF、EKLF、EPHB4及Sp1的表达均下调；而GATA1、GATA2、NF-E2等表达无改变。